Toll樣受體信號轉導通路與急性肺損傷的研究進展①

李玉華 綜述 趙 敏 審校

(中國醫科大學盛京醫院急診科，沈陽 110004)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是一種威脅生命的疾病，可能與嚴重感染、休克、創傷、急性重癥胰腺炎或燒傷有關，其特征在于非心源性肺水腫、呼吸窘迫、低氧血癥等[2]。嚴重的ALI可導致急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)，表現為頑固性低氧血癥、肺順應性降低、呼吸衰竭等[3]。近年來，對ALI/ARDS的定義、發病機制和診治的研究取得了很大進展，但由于其發病機制尚不完全明確，治療仍較為困難。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)屬于天然免疫系統的首要調節因子，在機體抵抗外來病原體并誘導機體免疫應答中起著至關重要的作用[3]，同時其對組織損傷等來源的內源性配體的識別可參與調節組織修復的過程，因此研究TLRs與肺損傷發病機制間的關系可為臨床治療提供新的思路。

1 TLRs簡介

1.1結構與功能 TLRs是一種連接固有免疫與獲得性免疫的重要模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，在上皮細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞及巨噬細胞都有表達，廣泛分布于機體各個部位[4]。TLRs種類眾多，目前已發現人TLRs有10種，分別命名為TLR1～TLR10，其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6位于細胞表面，TLR3、TLR7、TLR8、TLR9位于細胞內囊泡中，TLR10作為一種偽基因，不具備識別病原體和信號轉導功能[5]。TLRs由能識別受體及與其他輔助受體結合形成受體復合物的胞膜外區、含Toll-IL-1受體結構域(Toll-IL-1 receptor domain，TIR)的胞質區以及跨膜區3部分組成，在結構上胞外區具有富含亮氨酸的重復序列(leucine-rich repeats，LRRs)，參與識別各種病原體。而含有TIR的胞質區作為TLRs的核心區域可介導多種下游信號級聯反應，激發其他信號通路的產生[6]。

TLRs作為一種進化上保守的Ⅰ型跨膜蛋白，是一種重要的PRRs，可同時觸發病原體相關分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)和損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)[7-8]。PAMPs主要來自病原或非病原微生物的外源性分子，包括革蘭氏陰性菌外膜中的脂多糖、革蘭氏陽性菌細胞壁中的肽聚糖、鞭毛蛋白和病毒雙鏈RNA(dsRNA)等。TLRs通過識別不同PAMPs引起特異性免疫應答，目前發現的配體蛋白有四種，分別為MyD88、Mal也稱TIRAP、TRIF和TRAM[9-10]。除了PAMPs，TLRs還可識別來自機體應激、組織損傷、無菌性炎癥及退化等產生的內源性分子即DAMPs,如高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、熱休克蛋白(HSPs)和透明質酸等[11]。不同的TLR成員識別不同的PAMPs和一些內源性的DAMPs，在感染及非感染性疾病中啟動天然免疫反應和引發抗原特異性的獲得性免疫[8]。

1.2TLRs的信號轉導通路 TLRs的激活既可誘導先天性炎癥反應，也可激活抗原適應性免疫應答反應。目前研究已證明，活化TLRs信號傳導途徑主要有兩條：一種是由MyD88銜接蛋白介導的MyD88依賴性信號轉導通路，另外一種是MyD88非依賴性信號轉導通路[12]。MyD88依賴性信號轉導通路：除TLR3以外的所有TLRs誘導的炎癥反應都經過一條經典的信號通路，該通路與TLRs的一段胞內保守序列TIR密切相關[13]。活化的TLR胞內結構域TIR與MyD88羧基端結合，并且MyD88的氨基端與IL-1受體相關激酶的氨基端結合，進而誘導白細胞介素受體相關激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase,IRAK)自身磷酸化，獲得磷酸化IRAK1和IRAK4，磷酸化IRAK1可結合并激活腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)，活化的TRAF6導致轉錄因子核因子κB(nuclear factor kapppaB，NF-κB)和激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)的活化，最終誘導炎癥細胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和趨化因子的基因表達和釋放[14-15]。MyD88非依賴性信號轉導通路：TRIF在MyD88依賴途徑中發揮重要作用。在此過程中，TLR3和TLR4可以通過TRAM募集并激活干擾素(IFN)-β的包含TIR結構域的TRIF，與TRIF相互作用后激活TRAF3，進而使干擾素調節因子-3(interferon regulator factor-3，IRF-3)磷酸化，最終促進抗炎因子如IFN-α、IFN-β、IL-10和TGF-β等的釋放。與此同時，TLR4激活的TRIF也可募集受體相互作用蛋白1(RIP1)和下游的TRAF6，從而啟動NF-κB途徑[12,16]。需要指出的是，TLR4是目前研究最廣泛的TLRs之一。由TLR4介導的信號通路既可以是MyD88依賴性的，也可以是MyD88非依賴性的，具體是哪種類型的通道與配體的特異性相關[17]，TLR4的這一特性使其在感染性及非感染性急性器官功能障礙中發揮著重要作用[18]。

此外，TLR4作為配體脂多糖(lipopolysaccha-ride,LPS)作用的經典受體，還可以激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)途徑，LPS刺激TLR4活化可促進PI3K及其下游分子蛋白激酶B(PKB，也稱AKT)與MyD88形成復合物，進而導致NF-κB的活化，該途徑與細胞生存、生長、血管生成及代謝等密切相關[19]。

2 TLRs與感染性肺損傷

TLRs與許多肺相關性免疫反應和病理密切相關，越來越多的證據表明，TLRs在ALI的先天和適應性免疫反應中起著關鍵作用[20-21]。早期大量研究已證實TLR4參與革蘭陰性桿菌LPS的識別和跨膜轉導，TLR4基因突變或TLR4基因缺陷的小鼠表現為對LPS具有低反應性和對革蘭陰性桿菌高度易感性[22]。在肺炎克雷伯桿菌感染的TLR4缺陷小鼠中，發現TLR4基因缺陷的小鼠在清除肺炎克雷伯桿菌方面的能力明顯下降，炎癥介質釋放減少以及降低小鼠生存率，表明TLR4介導的信號傳導可誘導針對肺炎克雷伯桿菌肺感染的保護性免疫應答[23]。在含有肺炎鏈球菌感染TLR4突變(C3H/HeJ)和對照組野生型(C3H/HeN)小鼠，發現TLR4突變的小鼠對肺炎球菌溶血素識別產生障礙，并對肺炎鏈球菌表現出易感性，細胞和血液中細菌計數增加，存活時間縮短[24]。MyD88作為TLRs(TLR3除外)信號轉導介導的先天免疫反應中的關鍵配體，在調節細菌感染誘導的炎癥反應中發揮著關鍵作用[13,25]。研究表明MyD88突變與免疫缺陷密切相關，而免疫缺陷使患者容易發生反復的危及生命的細菌感染，類似情況在MyD88缺陷小鼠中也有所觀察[26]。這些發現均提示了TLRs信號通路及其完整性對特異的病原感染的免疫應答具有重要作用。

TLRs在病毒及真菌等感染方面也扮演著重要的角色。TLRs是識別病毒分子模式的傳感器，從而啟動針對入侵病毒的先天免疫反應。TLR3缺陷小鼠對嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)易感，肺組織中病毒滴度高于正常野生型小鼠，這一發現強調了TLR3誘導針對SARS-CoV感染的先天免疫反應的作用[27]。TLRs作為先天免疫的重要誘導者，在真菌感染的檢測中也起著重要作用。在煙曲霉誘導的侵襲性肺曲霉菌病中發現，TLR2缺陷小鼠肺巨噬細胞對煙曲霉的反應性低下，較對照組小鼠TNF-α、IL-12等的濃度更低，小鼠存活率明顯降低[28]。ZHANG等[29]首次報道了TLR2介導了光滑念珠菌(Candida glabrata)感染大鼠支氣管上皮細胞的先天免疫反應及炎癥反應，TLR2基因敲除可進而加重光滑念珠菌對支氣管上皮細胞損傷程度，提高支氣管上皮細胞對光滑念珠菌的易感性[29]。這些實驗數據證實TLRs在微生物的識別和清除中發揮一定作用。

大多數的感染模型都顯示出TLRs的保護性作用，但有動物實驗證實，感染廣泛耐藥結核桿菌(XDR-TB)的小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10水平低于感染藥物敏感型結核桿菌(DS-TB)的小鼠。此外，與感染DS-TB的小鼠相比，感染XDR-TB的小鼠存活時間更長，并且肺泡損傷的嚴重程度更輕以及肉芽腫形成面積更小。進一步研究發現感染XDR-TB的小鼠TLR2、TLR4的表達量更低，推斷XDR-TB小鼠的低毒力歸因于通過TLR2和TLR4途徑的細胞因子表達減少[30]。通過腹腔注射內毒素誘導的ALI動物模型中發現，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路可減輕肺泡損傷、減少肺泡炎癥細胞浸潤、降低炎癥因子的表達，從而改善肺功能[31]。因此，各種不同的TLRs在感染性肺損傷中的作用存在一定差異，它們介導炎癥的具體機制有待于進一步深入研究和探索。

3 TLRs與非感染性肺損傷

在動物模型中，研究發現TLRs與ALI的啟動和免疫調節有著密切的聯系。大量的數據說明，TLR2和TLR4不僅針對感染性刺激發生炎癥反應和作出免疫應答，也可以調節并促進非感染性刺激誘導的組織損傷的發生。HOTH等[32]模擬人類常見創傷性肺損傷的動物肺挫傷模型中已經發現，TLR2和TLR4的激活介導了肺損傷的炎癥反應。肺部挫裂傷可激活TLR2和TLR4信號通路，通過MyD88依賴性途徑誘導趨化因子CXCL-1及TNF-α等炎癥介質的表達，從而引起中性粒細胞在肺部聚集[32]。

炎癥級聯反應是加重肺損傷的重要原因，TLRs的過度活化可導致炎癥因子和抗炎因子之間的不平衡，因此對TLRs介導的NF-κB信號通路進行適當抑制可在一定程度上減輕非感染性肺損傷。LIU等[33]的研究表明TLR2通過p38-NF-κB和ERK-AP-1信號通路介導博來霉素誘導小鼠樹突狀細胞的成熟和細胞因子IL-6、IL-17、IL-23及趨化因子MCP-1的分泌，阻斷TLR2的信號傳導可顯著減輕博來霉素誘導的肺損傷、炎癥與纖維化，提高動物生存率。LI等[34]在高潮氣量機械通氣誘導ALI研究中發現，TLR4和MyD88缺陷小鼠中NF-κB和MAPK的活化減少，減輕了細胞因子的表達和炎癥反應。預防TLR9介導的中性粒細胞過度募集可以減少煙霧暴露誘導的肺損傷，TLR9的缺陷可降低煙霧誘導肺損傷中炎癥細胞浸潤程度，抑制肺組織細胞凋亡，在一定程度上改善肺功能[35]。同樣，對TLR3介導的NF-κB活化的抑制可以減輕缺血再灌注肺損傷嚴重程度，ZHANG等[36]研究結果顯示TLR3的缺陷可能通過減少肺細胞凋亡和炎癥反應來減輕缺血再灌注引起的肺損傷。也有研究發現TLR4參與并介導了百草枯誘導的ALI，TLR4基因的缺陷可逆轉炎癥因子如TNF-α、IL-1β、NF-κB等過表達造成的嚴重肺損傷，減輕肺組織病理損害[37]。TLR9的表達與百草枯誘導的肺損傷嚴重程度相關，TLR9表達量越高，肺損傷越嚴重[38]。百草枯中毒可通過MyD88依賴性途徑激活NF-κB信號通路，刺激炎癥因子TNF-α、IL-1等的表達和釋放，導致ALI。而MyD88基因敲除可減弱百草枯誘導ALI的嚴重程度，通過抑制炎癥級聯反應、恢復炎癥因子抗炎因子之間的平衡改善肺功能[39]。

4 小結與展望

肺部在病原體感染和非感染性環境損傷的長期暴露可引起嚴重肺損傷，而先天免疫系統在維持肺組織穩態中發揮關鍵作用。TLR主要參與先天免疫系統的激活，并且近年來已經進行了大量研究以探索TLR在宿主防御和組織穩態中的作用，為重新認識肺部疾病中的炎癥過程及減輕肺損傷打下了堅實的基礎。而TLRs的激活也是一把雙刃劍，它可通過識別PAMPs和DAMPs刺激先天性免疫應答并提高獲得性免疫應答保護機體，同時由TLRs激活的信號傳導所引起的持續性炎癥反應可對機體產生損傷。盡管TLR激活在肺炎性疾病的進展中起著關鍵作用，但仍有許多問題需要回答。除此之外，使用TLR作為治療靶標涉及使用TLR激動劑或拮抗劑，由于劑量毒性和給藥時間及途徑的不易控制，目前很少有TLR激動劑和拮抗劑被用作ALI的治療方式。因此，需要更多的研究來探索TLR作為治療策略的潛力。此外，對TLRs相關機制的深刻理解有助于我們闡明先天免疫系統與ALI發生發展之間的聯系，可為包括肺損傷在內的感染性疾病和非感染性損傷提供新的思路。