液相色譜-原子熒光光譜法測定食用菌中的砷形態

劉 洋 劉麗萍 陳紹占

(1.首都醫科大學 公共衛生學院，北京 100069； 2.北京市疾病預防控制中心，食物中毒診斷溯源技術北京市重點實驗室，北京100013； 3.北京市預防醫學研究中心 100013)

前言

野生食用菌由于味道鮮美，富含氨基酸，營養豐富[1-2]，成為人們餐桌上的“常客”。然而，有研究表明[3-4]，由于食用菌富集重金屬的能力很強，因而食用菌中重金屬含量超標現象也屢見不鮮。砷是人們熟知的重金屬之一，長期過量攝入會導致皮膚癌、肺癌等疾病，由于砷的形態很多，不同砷形態毒性不同，以砷化合物的半數致死量來計，其毒性大小依次為As(Ⅲ)>As(Ⅴ)>MMA>DMA>砷甜菜堿(AsB)，As(Ⅲ)和As(Ⅴ)之和統稱為無機砷，無機砷毒性大，是致癌物質，而砷甜菜堿(AsB)等有機砷[5]幾乎無毒，因此目前砷仍是研究的熱點。《食品安全國家標準 食品中污染物的限量》(GB 2762—2017)中規定食用菌總砷的限量為0.5 mg/kg。隨著研究的不斷深入[6]，發現野生食用菌中存在不同的砷形態，為了更好地評估食用菌的安全性，新修訂的《食品安全國家標準 食品中污染物的限量》(GB 2762-20XX)的征求意見稿中，將食用菌的總砷限量修改為無機砷限量，增加了銀耳、木耳等食用菌中無機砷限量規定。

砷形態的分析檢測方法主要有高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜(HPLC-ICP-MS)法[7-8]、液相色譜-原子熒光光譜(LC-AFS)法[9]、離子色譜-電感耦合等離子體質譜(IC-ICP-MS)法[10]、毛細管電泳-電感耦合等離子體質譜(CE-ICP-MS)法等。其中，高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法因其靈敏度高、分離效果好等優點被廣泛應用，但因其儀器價格和運行成本較高也限制了它的使用，液相色譜-原子熒光光譜法因價格成本較低、實用性強也得到廣泛使用。

本實驗選用新型的配有氫氣發生器的液相色譜-原子熒光光譜儀分析研究食用菌中砷形態，氫氣發生器的使用極大地節約了化學試劑的用量，所提供的穩定的氬氫火焰使得原子化效率更高，提高了檢測靈敏度，操作方便。當不開紫外消解燈時砷甜菜堿等有機砷不能準確測定，本文主要對食用菌中亞砷酸根As(Ⅲ)、一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)、砷酸根As(Ⅴ)四種砷形態進行分析研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

配有自動進樣器的Prin-Cen液相色譜儀(廣州普臨晟科技有限公司)；原子熒光光譜儀(北京寶德儀器有限公司)；Hamiton PRPX-100色譜柱及其保護柱；Milli-Q Integral超純水處理系統(美國 Millipore公司)；新芝超聲波清洗器；高速離心機(美國Beckman公司)。

磷酸氫二銨[(NH4)2HPO4]、硼氫化鉀(KHB4)、氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)、氨水(NH3·H2O)、過氧化氫(H2O2)等均為分析純試劑(國藥集團化學試劑有限公司)；65%硝酸(德國Merck)；亞砷酸根As(Ⅲ)(GBW 08666)、一甲基砷酸(MMA，GBW 08668)、二甲基砷酸(DMA，GBW 08669)、砷酸根As(Ⅴ)(GBW 08667)、砷甜菜堿(AsB，GBW 08670)等砷形態標準溶液均購于中國計量科學研究院。

1.2 樣品前處理

1.2.1 砷形態測定前處理

稱取食用菌試樣0.5 g(準確至0.000 1 g)于50 mL 聚丙烯離心管中，加入20 mL硝酸(0.15 mol/L)，于60 ℃超聲水浴中提取1 h，取出冷卻至室溫，于8 000 r/min離心10 min，吸取上層清液，經0.45 μm有機濾膜過濾后上機測定。按同一操作方法做空白實驗。

1.2.2 總砷測定前處理

采用 GB 5009.11-2014《食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定》中電感耦合等離子體質譜法，稱取0.3 g(準確至0.000 1 g)樣品于微波消解罐中，加入6 mL濃硝酸和1 mL過氧化氫放置1 h，按相關操作步驟進行消解，冷卻后，定容至25 mL，上機測定。

1.3 儀器工作參數

各儀器最佳工作參數見表1。

表1 LC-AFS儀器參數

2 結果與討論

2.1 色譜柱的選擇

陰離子交換色譜柱是目前用于砷形態分析最為廣泛的色譜柱，常用的陰離子交換色譜柱有Hamilton PRPX-100、Dionex Ion Pac AS19等。其中，Hamilton PRPX-100[11-12]適用的pH值范圍較廣，在pH值為1～13范圍內均適用，分離效果好，普適性強，價格適宜，出峰時間穩定，樣品的前處理選用0.15 mol/L的硝酸提取時，其溶液呈酸性，此色譜柱較適宜，AS19色譜柱在酸性條件下，柱效會受到一定的影響，影響使用壽命，且價格較昂貴。因而本實驗選用Hamilton PRPX-100色譜柱。

2.2 流動相的優化

由于食用菌中存在AsB等有機砷，需采用梯度洗脫進行砷形態的有效分離，液相色譜-原子熒光光譜法常用的分離體系A：1 mmol/L (NH4)2HPO4(pH=9)，B：20 mmol/L (NH4)2HPO4,對其進行優化，由于通常情況中As(Ⅴ)的靈敏度較低，對流動相B進行優化，分別配制(20、25、30 mmol/L)的 (NH4)2HPO4，通過測定1 mg/L AsB和10 μg/L的As(Ⅲ)、MMA、DMA、As(Ⅴ)的混合標準溶液，不同濃度的流動相所對應的響應值如圖1所示，隨著流動相濃度的增加，As(Ⅴ)的信號響應值逐漸增加且出峰時間逐漸縮短，當采用30 mmol/L時，信號響應值和出峰時間均較好，因此，選擇流動相B選擇30 mmol/L(NH4)2HPO4為宜。

2.3 樣品提取條件的優化

本次實驗選用總砷含量較高的姬松茸進行優化，分別考察了硝酸(0.15 mol/L) 60 ℃超聲1 h、100 ℃微波輔助提取和90 ℃熱浸提1 h三種不同的提取方法對砷形態的提取效果，如圖2可知，采用硝酸(0.15 mol/L) 60 ℃超聲1 h方式提取砷效果較好，且方法簡單便于操作，測定結果表明此樣品不含有DMA 。

圖1 不同濃度流動相B的砷形態分離色譜圖Figure 1 The separation chromatogram of arsenic species in different concentration mobile phase B.

圖2 不同提取方法對于砷形態的影響Figure 2 Effects of different extraction methods on arsenic species.

2.4 氫氣發生器氫氣輸出流量的考察

實驗表明，通過氫氣發生器的使用，使得原子熒光光譜法所用還原劑和載流的使用量大大減少，當開機測定砷形態6 h以上時較傳統LC-AFS儀器的還原劑和載流的使用量約減少2倍，實驗中發現在不同的氫氣輸出流量下，四種砷形態的靈敏度不同，為了探究氫氣的最佳輸出流量，配制濃度為10.0 μg/L的As(Ⅲ)、MMA、DMA、As(V)的混合標準溶液，在最佳儀器狀態下考察，發現隨著氫氣輸出流量的增加(見圖3)，信號強度增加，當增加到110 mL/min時，信號強度達到了一個較優值，當流量大于110 mL/min后，信號強度緩慢下降，且當氫氣輸出流量過大時，會影響砷形態的測定。因此最終選用氫氣輸出流量為110 mL/min。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性范圍及檢出限

通過線性范圍實驗，結果表明本方法線性范圍較寬，在0～100.0 μg/L的濃度范圍內，線性相關系數均達0.999以上，圖4為濃度10 μg/L 時4種砷形態化合物色譜圖。將As(Ⅲ)、MMA、DMA、As(Ⅴ) 四種砷的混合標準儲備液逐級稀釋測定方法檢出限，以3倍基線噪聲時砷形態的濃度為檢出限(S/N=3)，結果見表2，該儀器的檢出限較傳統LC-AFS[13]有明顯的優勢。

圖3 不同氫氣輸出流量對砷形態信號強度的影響Figure 3 Effects of different hydrogen output flow rates on arsenic species signal intensity.

表2 線性范圍及檢出限

圖4 4種砷形態色譜圖(10 μg/L)Figure 4 Chromatogram of four arsenic species(10 μg/L).

2.5.2 方法的準確度和重現性實驗

以加標回收實驗考察方法準確度，以精密度來考察方法的重現性。

2.5.2.1 模擬樣品精密度及加標回收實驗

選用干姬松茸、鮮杏鮑菇、銀耳不同類別的食用菌，添加三個不同濃度水平的混合標準溶液進行回收率實驗，加標回收率在80.2%～106%。平行制備6個模擬樣品進行精密度實驗，計算相對標準偏差(RSD)，實驗結果表明RSD值均小于5%，結果見表3、4、5，實驗結果證明方法的重現性和準確度滿足實驗要求。

2.5.2.2 實際樣品的精密度

選取砷含量較高的有機元蘑和牛肝菌進行方法精密度的測定，制備6個平行樣品，測定其砷形態含量，分別計算相對標準偏差(RSD)，結果如表6所示，RSD值均小于5%。

2.6 實際樣品分析

采集市售食用菌樣品，根據GB 5009.11—2014方法一測定總砷，選擇按GB 2762—2017判定總砷含量超出0.5 mg/kg的限量標準的楊樹蘑、黃蘑、紅蘑、草蘑、牛肝菌、姬松茸等樣品，采用所建方法進行砷形態測定，分析結果見表7，其中編號10的野生食用菌總砷含量高達26.6 mg/kg，測定其砷形態如圖5所示，在未開紫外消解燈的情況下，其有機砷AsB含量仍然較高，無機砷含量相對較低，而編號為11的有機元蘑中無機砷含量高達1.76 mg/kg，實驗表明總砷含量高的食用菌(圖6)，并不意味具有食品安全問題，快速準確測定食用菌中無機砷非常重要。

表3 姬松茸加標回收率和精密度

表4 銀耳加標回收率和精密度

表5 鮮杏鮑菇加標回收率和精密度

表6 實際樣品精密度測定結果

表7 食用菌四種砷形態含量

圖5 編號10的野生食用菌砷形態色譜圖 Figure 5 Chromatogram of arsenic speciations in wild edible No.10.

圖6 編號11的有機元蘑砷形態色譜圖Figure 6 Chromatogram of arsenic speciations of organic mushroom No.11.

3 結論

建立了液相色譜-原子熒光光譜法測定食用菌中砷形態的方法，在未開紫外消解燈的情況下可以準確測定食用菌中四種砷形態，使用氫氣發生器可以大大減少還原劑和載流的用量，提高無機砷測定的靈敏度。通過實際樣品測定表明，總砷含量高，并不意味無機砷含量高，不能代表其具有食品安全問題，因此對食用菌中有害的無機砷測定非常必要，以保證食品安全。實驗結果表明，本方法操作方便，靈敏度高，準確、可靠，適用于食用菌中DMA、MMA和無機砷的測定，可為食用菌的安全評估提供技術支持，為《食品安全國家標準 食品總砷及無機砷的測定》(GB 5009.11—2014)方法的修訂提供保證。