干細胞移植治療1 型糖尿病的研究進展

張 芮司 維*

(1.昆明理工大學靈長類轉化醫學研究院,昆明 650500;2.省部共建非人靈長類生物醫學國家重點實驗室,昆明 650500)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是由于胰島素分泌不足或胰島素抵抗引起的以高血糖為特征的一組慢性代謝疾病,主要分為1 型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM)、 2 型 糖 尿 病 (Type 2 diabetes mellitus, T2DM)、妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)和單基因糖尿病[1]。 根據國際糖尿病聯盟(http:/ /www.diabetesatlas.org/)的統計,截至2019 年全球糖尿病患者超4.63 億,預計2045 年將增至7 億。 中國已成為糖尿病第一大國,患者超過1.16 億。 其中,T1DM 是一種由T 淋巴細胞介導的自身免疫性疾病。 由于胰島β 細胞受損而導致胰島素分泌不足[1],T1DM 患者需要完全依賴外源胰島素治療。 雖然胰島素治療已從過去的“每日餐前一針”發展到“人工智能控制的胰島泵”[2],但并不能根治,也不能防止包括視網膜病變、神經病變等一系列并發癥的發生[3]。 近年來,胰島移植結合免疫抑制已成功應用于T1DM 的治療[4],但由于供體器官嚴重缺乏、需要終身免疫抑制以及胰島移植后難以長期存活等問題限制了臨床應用[5]。 因此,干細胞替代療法有望成為治療T1DM 的醫學發展新途徑[6],就應用干細胞誘導分化產生功能性胰島β 細胞或胰島類器官替代治療T1DM 的研究進展作一綜述,為干細胞治療T1DM的臨床轉化提供參考和借鑒。

1 體外誘導干細胞分化為胰島素分泌細胞

胰島β 細胞的再生和替代治療被認為是治愈T1DM 的有效途徑,目前研究多為基于動物模型的臨床前研究,主要以人胚胎干細胞(human embryo stem cells,hESCs)、人誘導多能干細胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)和成體干細胞(adult stem cells,ASCs)等為種子細胞定向誘導分化,并通過細胞移植修復或替代受損胰腺組織[7]。

1.1 胚胎干細胞的替代療法

自2001 年首次發現hESCs 能在體外自發分化為產胰島素的細胞以來[8],許多分化方案被陸續報道,產生了多激素細胞的混合群體,但整體分化效率低下且胰島素含量低。 2006 年 D’Amour 等[9]模擬胰腺發育,使用五步誘導法分化出含有7%胰島素陽性細胞的內分泌細胞團,但缺乏對葡萄糖刺激產生反應的功能。 Kroon 等[10]誘導hESCs 定向分化為胰腺祖細胞,移植到免疫缺陷小鼠體內進一步成熟為功能性的胰島β 樣細胞,并可以維持3 個月的體內葡萄糖穩態。 2014 年Rezania 等[11]取得重大突破,采用七步誘導法從hESCs 中分化出表達胰島β 細胞關鍵標志物包括MAFA和INS等的胰島β 樣細胞,移植后2~6 周就能成功逆轉DM 小鼠血糖。此外,Pagliuca 等[12]開發了懸浮培養系統能大規模生產 hESCs 衍生的胰島 β 細胞(SC-β 細胞)。 鑒別分化過程中形成的細胞類型對提高β 細胞的分化比例尤為重要,最近一項研究利用單細胞RNA 測序技術對hESCs 誘導分化產生的細胞類型進行了分析,鑒定出了胰島β 細胞、α 樣多激素細胞、非內分泌細胞和未曾報道過的腸嗜鉻細胞,而且用攜帶CD49a 抗體的微珠磁性分選成功富集到80%以上的SC-β 細胞[13-14],為進一步的臨床轉化應用奠定了基礎。

目前,所有hESCs 誘導分化胰島β 細胞的方案都依賴于對生長因子以及分子信號通路激活或抑制的調控,例如最近提出的優化方案:抑制YAP 促進胰島β 細胞生成,改善胰島素分泌功能[15];抑制WNT 通路提高分化效率,增加內分泌細胞的比例[16]等。 盡管利用 hESCs 分化生產胰島 β 細胞已經取得了顯著進展,但仍存在如hESCs 的倫理限制以及異體細胞排斥反應等障礙,而且不同的hESCs細胞系分化能力也存在差異,限制了其臨床應用[17]。

1.2 誘導多能干細胞的替代療法

利用患者自體細胞通過重編程獲得hiPSCs,定向誘導分化獲得遺傳背景一致的胰島β 細胞,在治療 T1DM 方面有巨大潛力[18]。 2008 年 Tateishi等[19]首先證明了皮膚成纖維細胞來源的hiPSCs 能夠通過模擬胰腺發育在體外產生胰島樣簇,隨后Zhang 等[20]誘導分化的胰島素生成細胞能檢測到PDX1 的表達和C 肽的合成。 針對hESCs 開發的胰島β 細胞分化方案已成功應用于hiPSCs[11]。 值得注意的是,胰腺祖細胞中PDX1 和NKX6.1 的共表達對于有效生成功能性胰島β 細胞是必不可少的,Russ 等[21]去除了常用的BMP 抑制劑,使用維甲酸聯合EGF/KGF,有效地誘導出PDX1+/NKX6.1+胰腺祖細胞群,產生對葡萄糖刺激有反應的胰島β 樣細胞,降低 DM 小鼠血糖,在短期移植后仍保持功能。

hiPSCs 來源的胰島β 細胞結合基因編輯技術是細胞療法的一個主要方向。 Maxwell 等[22]利用Wolfram 綜合征患者的hiPSCs 誘導分化為胰島β 細胞,使用CRISPR-Cas9 技術糾正細胞WFS1 基因的突變后移植到 DM 小鼠體內逆轉了血糖,這是CRISPR 首次被用于修復DM 患者的遺傳缺陷,開啟了基因編輯結合細胞治療DM 的新篇章。 CRISPR基因誘導系統(CRISPR-on)是一種新型的RNA 引導的轉錄激活系統,Giménez 等[23]用融合了轉錄激活因子(dCas9-VP160)的 CRISPR-ON 系統轉染T1DM 患者的成纖維細胞,激活胰島β 細胞發育基因如內源性人胰島素基因(INS),增強了胰島素分泌。 但目前患者來源的hiPSCs 分化效率較低[24],還存在腫瘤轉化風險、基因組不穩定及成本高等諸多不利因素。

1.3 成體干細胞的替代療法

ASCs 是存在于成年后各組織器官中具有自我更新能力和分化潛能的細胞。 可從T1DM 患者中分離出成體干細胞,在體外定向誘導分化為胰島β 細胞,再移植回患者體內達到長期治療的目的。 具有強大免疫調節特性、多向分化潛能、自我更新能力的間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)在臨床試驗中得到了廣泛的應用[25]。 MSCs 調控促炎癥作用的效應T 細胞,抑制自身免疫反應,單獨或與胰島β 細胞聯合移植可有效逆轉T1DM 患者的高血糖狀況[26],使T1DM 患者體內剩余的胰島β 細胞功能得以部分恢復或延遲細胞損傷[27]。 近年來,許多研究團隊把不同來源的人MSC 誘導分化為胰島β 細胞,在DM 小鼠體內可分泌胰島素,表現出與人胰島β 細胞相似的Ca2+變化和L 型Ca2+通道活性[28]。 另一方面,將胰腺關鍵轉錄因子如PDX-1等基于病毒介導轉染MSC 也能獲得具有胰島β 細胞功能的細胞[29]。

脂肪組織來源的間充質干細胞(adipose tissuederived MSCs,ADMSCs)因其來源豐富且易于分離成為目前研究的焦點之一。 使用 ADMSCs 治療T1DM 的方法大致可以分為以下四類:(1)ADMSCs誘導分化胰島素分泌細胞(Insulin-producing cells,IPCs) 用于移植治療 T1DM[30],在分化過程中ADMSCs 的免疫調節特性能得到維持[31],與未分化的ADMSCs 相比,IPCs 可以耐受移植物排斥反應。(2)單獨移植ADMSCs 治療T1DM 能改善胰島功能,增加血清胰島素水平[32],其治療有效性在T1DM 動物模型中已得到認可,但單獨使用ADMSCs治療還局限于T1DM 患者發病早期[33]。 (3)許多研究小組闡明使用ADMSCs 聯合胰島移植的有效性和多功能性,發現ADMSCs 聯合移植治療可以逆轉T1DM 小鼠血糖,明顯抑制炎癥細胞浸潤,促進移植物血管生成,延長存活時間[34]。 (4)ADMSCs 還被用于培養胰島,在移植前將ADMSCs 與胰島共培養有助于提高胰島的生存能力,增加胰島素釋放,能顯著改善DM 小鼠的高血糖癥狀[35]。

此外,Wang 等[36]對成年小鼠胰島進行單細胞RNA 測序,發現了特異表達蛋白C 受體 (Procr)的胰島成體干細胞,在體內正常生理狀態下可分化形成四種類型的內分泌細胞,進一步培養可形成穩定的胰島類器官,該研究回答了長期以來成體胰島是否存在干細胞這一爭議性問題,是干細胞基礎研究的重大突破。 未來,胰島成體干細胞將有望應用于T1DM 的治療。

ASCs 獲取相對容易,不存在倫理問題,同種異體免疫排斥反應與致瘤風險低,目前研究多集中在測試其恢復免疫穩態以及再生胰島β 細胞的潛力。

2 干細胞衍生的胰島類器官

天然胰島是由 α,β,δ,ε 和 PP 細胞形成的異質結構,這種3D 構象產生的細胞間相互作用在調節激素分泌方面發揮著重要作用[37]。 胰島類器官(pancreatic organoids,POs)是由原代胰腺組織或干細胞形成的與體內胰島功能和組織類似的三維結構,是研究生理及病理條件下胰島細胞的增殖分化及其與微環境的相互作用的理想方法。 大量研究表明,干細胞可以產生功能性POs,當植入不同的臨床前DM 動物模型時,能夠恢復至正常血糖。 2016年Kim 等[38]從 hESCs 衍生的hPOs 在體內和體外均顯示出葡萄糖反應;隨后,Wang 等[39]基于仿生3D 支架生成的hPOs 表達高水平的胰島β 細胞標志物如PDX-1、Ngn3、Insulin等,更重要的是,這些hPOs 類似于成人胰島,含有多種胰腺內分泌細胞,對葡萄糖刺激更敏感,高糖條件下胰島素的分泌急劇增加,這是胰島β 細胞成熟的標志之一。 此外,一個重大突破是hPOs 植入DM 小鼠體內后,3 d內迅速恢復血糖;相比之下,在之前的研究中,僅移植干細胞誘導分化的胰島β 細胞至少需要超過40 天才能使DM 小鼠的血糖水平恢復正常[10-12,21]。 研究表明,干細胞衍生的hPOs 在細胞組成和胰島微結構等方面都更接近天然胰島[40]。

hPOs 移植體內后面臨著氧合和宿主免疫反應的激活導致hPOs 功能逐漸喪失的難題。 近年來的研究通過生物材料包封提供免疫分離生物相容性,優化營養擴散和胰島素釋放,使植入的hPOs 實現長期生存并發揮功能[41]。 海藻酸鹽微膠囊能提供更好的細胞氧合促進hESCs 分化聚集為hPOs[40]。Vegas 等[42]使用經三唑硫代喹啉二氧化物(TMTD)修飾的藻酸鹽包封SC-β 細胞,在沒有任何免疫抑制的情況下可為T1DM 小鼠提供長達174 d 的血糖校正。 TMTD 藻酸鹽在非人靈長類動物中也開展了實驗,顯著地降低異物反應[43]。 最近,海藻酸鈉與免疫調節趨化因子CXCL12 共包被SC-β 細胞,移植到T1DM 小鼠中促進了胰島素分泌并實現長期的免疫保護,有效地延長 SC-β 細胞的生存時間和功能[44]。 這些發現為進一步開展T1DM 大動物模型治療的臨床前研究和臨床轉化奠定了基礎。

另外,為了移植物能長期存活,可以通過形成新的血管獲得宿主的營養和物質支持。 Wang 等[36]建立了Procr+胰島干細胞與血管細胞共培養的3 D體系,成功獲得與小鼠胰島功能、形態、超微結構及轉錄組都相似的POs,在體外培養能傳20 代以上,移植到DM 小鼠體內能夠恢復血糖水平。 內皮化也是解決hPOs 移植后血供問題的一種方法。 通過與內皮祖細胞共培養移植可增強支架血管的形成,研究發現干擾間充質調節因子(PDGF)受體或纖維連接蛋白,可以使MSCs 向具有內皮潛能的中胚層前體細胞轉化,在體內有效誘導新生血管形成[45]。 目前,納米技術通過使用不同的聚合物和天然ECM 作為封裝平臺有巨大潛力,Skrzypek 等[46]開發的聚醚砜/聚乙烯吡咯烷酮(PES/PVP)平板多孔膜,無需添加水凝膠即可創建早期微血管網絡[47],有望提高hPOs 存活時間。

3 展望

利用干細胞分化胰島β 細胞移植治療T1DM,能有效解決器官供體胰島短缺的問題。 然而,目前還沒有一種分化方案能夠生成功能完備的胰島β細胞以自我調節葡萄糖代謝,因此需要在細胞功能、移植后的存活率、遺傳穩定性和生產成本等方面進一步優化研究。 另外,干細胞移植治療T1DM向臨床過渡要面臨的挑戰,還包括如何保護移植物免受異種排斥,避免自身免疫的反復發生,尋找能最大程度減少細胞損失的移植方式和部位等,這些問題的解決將有效促進干細胞來源的胰島β 細胞替代治療的發展。