骨髓間充質干細胞治療阿爾茲海默病模型小鼠研究進展

路亞嵐石桂英王克維白 琳

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所 北京協和醫學院比較醫學中心國家衛生健康委員會人類疾病比較醫學重點實驗室北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心,北京 100021)

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease, AD),又稱老年癡呆癥,是一種原發性中樞神經系統退行性疾病。 AD 是一種慢性疾病,患者處于無外顯癥狀的臨床前期時間約8~10 年,65 歲以上老人發病率約1%~3%[1]。 AD 的發病率隨年齡增長呈逐漸上升趨勢,據報道,70 歲以后年齡每增加5 歲,AD 的危險性隨之增加1 倍[2]。 流行病學資料顯示,我國AD 患者人數已超過800 萬,約占全球的的1/5[3]。隨著我國人口老齡化程度的加劇,AD 成為繼心血管疾病、腫瘤和腦卒中之后的第4 位殺手。 AD 的主要臨床表現包括漸進性記憶障礙、失語、失用、失認、執行功能障礙以及人格和行為改變,并伴隨有一系列精神病癥狀[4]。 隨著病情呈進行性加重,后期患者幾乎無法正常思考和判斷,生活不能自理。確診AD 后,男性患者平均生存時間約4.2 年,女性患者約5.7 年[5]。 AD 的發生給患者及其家庭和社會帶來了巨大的身心痛苦和經濟負擔[6]。

AD 發病機理復雜,其神經病理學特征,主要包括老年斑、神經原纖維纏結以及神經元和突觸的丟失[7]。 老年斑以細胞外沉積的 β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein, Aβ)為核心,周圍是受損的軸突和樹突以及膠質細胞;神經原纖維纏結是由過度磷酸化的Tau 蛋白沉積所致,其主要聚集在神經元胞內,此外也可在樹突和軸突聚集,分別形成纖維網線和老年斑炎冠。 AD 患者常常伴隨著神經元和突觸的丟失,多見于顳頂葉和額葉及扣帶回部位[8-9]。這些病理特征導致腦神經元結構異常、神經網絡破壞和神經元信息交流障礙,是AD 患者認知記憶功能障礙和精神行為異常的主要原因。

目前,AD 治療以膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)拮抗劑為主[10]。 前者主要通過降低乙酰膽堿的水解速度從而提高其在患者體內的含量,后者通過抑制AD 患者過度激活的NMDA 受體、減少神經元凋亡來發揮作用。 它們可維持退化的神經元功能,但無再生修復功能,因此對于早期AD 患者的療效較好,但中晚期患者收效甚微,而且這些藥物治療并不能阻斷AD 病程進展。 到目前為止,確診的AD 患者往往為中后期,且常伴隨多種代謝疾病,可用治療方法非常有限。 此外,中草藥物和針灸對AD 患者的臨床癥狀也有不同程度的緩解,主要通過調理機體代謝和營養神經達到緩解癥狀的效果,但對AD 的治療并無針對性,且個體間療效差異較大[11-12]。 因此,進一步研究AD 的新治療方法是臨床急需攻關的重大問題。

1 BM-MSCs 治療AD 模型小鼠的細胞和動物模型概述

1.1 骨髓間充質干細胞特征

間充質干細胞(mesenchymal stem cell, MSCs)來源于中胚層,具有自我更新和多向分化潛能,且其免疫源性低,在再生醫學治療中作為“種子”細胞,是治療AD 的新型方法[13]。 骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSCs)來源于骨髓基質干細胞,作為最早被發現的MSCs,是探討 MSCs 應用研究的“金標準”[14]。 BM-MSCs 分離操作簡單,可體外培養;它的免疫源性低,可異體移植,在動物體內長期存活;而且它的應用符合倫理要求,是干細胞治療中的理想選擇[4]。

進一步深入研究發現BM-MSCs 具有歸巢性,移植后可轉移至損傷和炎癥部位,它不僅能向骨、軟骨和脂肪組織分化,還能在特定條件下分化為神經樣細胞,可補充和替代已退化的神經元,因此具有神經元再生潛能。 近年來,研究顯示BM-MSCs 不僅可以激活小膠質細胞、促進吞噬 Aβ 蛋白并釋放Aβ降解酶以減少老年斑沉積,而且還可以通過促進細胞自噬功能,增強對Aβ 蛋白的清除以延緩AD 的進展[15]。 此外,BM-MSCs 可分泌多種生長因子和抗炎因子,誘導血管生成和神經發生,增加突觸連接,調節免疫微環境,減少神經元凋亡,維持神經元活性[16]。 因此,BM-MSCs 不僅可預防/治療早期患者,對中晚期患者的治療也有廣闊的應用前景。

1.2 BM-MSCs 治療常用的AD 模型動物

目前,細胞移植治療中常用的AD 模型動物主要模擬淀粉樣變性的病理特征,分為Aβ 誘導的AD模型動物和遺傳修飾的模型動物兩類。 Aβ 是老年斑的主要成分,在海馬/腦室注射聚集態Aβ(Aβ1-42,Aβ1-40,Aβ25-35)片段可導致神經元凋亡,引起膠質細胞增生的炎癥反應進而產生淀粉樣變性,模擬老年斑的病理現象,形成學習記憶能力衰退的AD 動物模型[17]。 該種造模方法操作簡單,造模成功率高、穩定性好且耗時短,不僅可用于小鼠,也可以用于大鼠模型構建。 然而該方法在注射的過程中會難以避免造成腦組織穿透性機械損傷,造成不可預知的神經功能受損。

細胞移植治療中常用的遺傳修飾的動物模型為針對淀粉樣前蛋白(amyloid precursor protein,APP)、早老素1(presenilin-1, PS1)和相關基因突變體構建的多重轉基因小鼠模型。 APPswe/PS1dE9(APPK670N,M671LPSEN1ΔE9, APP/PS1)雙轉小鼠是最常用的遺傳修飾AD 小鼠模型,該雙轉小鼠表達突變的APP 和PS1 融合體,4 月齡時皮層與海馬產生淀粉樣蛋白沉淀,7 月齡水迷宮實驗中可檢測到認知記憶功能障礙;三轉小鼠模型3×Tg(APPK670N,M671LPSEN1M146VMAPTP301L),6 月齡時皮層與海馬有彌散分布地堅實淀粉樣蛋白沉積,6 月齡時通過水迷宮可觀察到認知功能障礙;5×FAD(APPK670N,M671LAPPV717IAPPV716VPSEN1M146LPSEN1L286V)小鼠是攜帶5 個家族性基因突變的APP/PS1 的AD 轉基因小鼠,該種小鼠從2 個月起皮層即出現老年斑沉積,并隨著月齡逐漸增加,4~5 月齡時通過Y 迷宮可觀察到認知功能障礙[18]。 迄今為止,尚未發現能夠完全模擬AD 的病理進程的動物模型。 因此,在具體的科學實踐中應根據實驗需求和條件來選擇合適的實驗動物模型[19]。

2 BM-MSCs 治療AD 模型小鼠的效果、機理及其特點

2.1 BM-MSCs 直接移植治療AD 動物模型

BM-MSCs 直接移植治療AD 動物模型,通過水迷宮實驗發現BM-MSCs 治療組小鼠的潛伏期縮短、穿臺次數增加,空間學習記憶能力增強,并接近對照野生型(wild type, WT)小鼠水平[20-21]。 結果顯示,BM-MSCs 可向損傷部位遷移,治療組小鼠皮層和海馬的淀粉樣蛋白沉積減少,進一步分析發現Aβ降解酶增加,例如腦啡肽酶(neprilysin),Aβ 周圍小膠質細胞數量增加,海馬內新生血管數量增加,它們可促進Aβ 的降解和轉運。 同時,BM-MSCs 減少APP/PS1 小鼠腦內Tau 蛋白的磷酸化水平[22-23]。也有研究發現BM-MSCs 可調控微環境的免疫活性,Lee 等[24]發現BM-MSCs 可抑制小膠質細胞的過度激活,其中炎癥因子腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α, TNFα),白細胞介素 1β(interleukin 1β,IL1β)表達降低,抗炎因子白細胞介素(interleukin 10,IL10)表達增加。 Garcia 等[25]發現類似現象,BM-MSCs 治療組小鼠海馬區的老年斑顯著減少,并伴隨著星型膠質細胞和小膠質細胞數量顯著減少。BM-MSCs 還可通過分泌因子調控神經元活性,據報道發現BM-MSCs 通過下調核因子E2 相關因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2, Nrf2)表達,降低氧化應激水平,減少神經元凋亡;也可通過上調營養因子,例如:腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF),神經生長因子(nerve growth factor,NGF)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表達,增加神經元標志物NeuN 的陽性細胞數量,促進神經元修復。 此外,還可通過減少乙酰膽堿和多巴胺的表達,促進谷氨酸神經遞質的表達。 在分子通路水平上,BM-MSCs 移植治療組可上調糖原合成酶激酶-3(Glycogen synthase kinase 3 beta, GSK-3β)表達量,激活Wnt 信號通路,促進海馬區神經發生,增進神經元內源性修復[26]。 基于臨床前動物模型的良好療效,國際上開展了多項AD 治療的臨床實驗,其中美國開展了兩項同種異體BM-MSCs 治療AD 的臨床研究,目前兩者分別處于在1 期和2 期階段(NCT02600130 和 NCT02833792)[27]。

隨著細胞傳代培養,BM-MSCs 逐漸出現衰老表型,傳代次數對BM-MSCs 的干性特征和分泌因子有顯著影響,衰老死亡的BM-MSCs 將喪失治療能力。全骨髓貼壁法分離的小鼠BM-MSCs 在第4 代可保持較好形態和多向分化能力。 然而,隨著傳代次數進一步增加,BM-MSCs 會出現細胞生長速度緩慢、核固縮、脫離等衰老特征。 大鼠BM-MSCs 的表面抗原CD29、 CD44 和CD90 表達隨傳代次數逐漸增加,經過5~6 代后達到頂峰,之后開始逐漸下降。 人源BM-MSCs 隨著傳代次數增加,其增殖能力和分化能力也均降低[28]。 梁維等發現第6 代的BM-MSCs 向神經干方向分化能力最強[29],一般認為7 代之前的BM-MSCs 有較強干細胞活性,適用于移植治療研究。

2.2 基因修飾的 BM-MSCs 移植治療 AD 小鼠模型

隨著對AD 發病機理研究和認識的不斷深入,眾多參與AD 發生發展過程的重要調控蛋白、RNA分子被相繼發現。 BM-MSCs 可作為一種新型基因治療的載體細胞,通過基因修飾方法對其進行改造,將基因治療與細胞治療相結合,使BM-MSCs 和調控分子的效應疊加,更能有效緩解/阻止甚至逆轉AD 的發展進程。 目前研究比較多的調控分子主要包括具有調控神經元生長和膠質細胞活性的分泌因子和非編碼RNA。 BM-MSCs 的基因修飾方法包括電轉導入、病毒導入以及轉基因動物直接分離。 其中,盡管病毒載體介導的基因修飾方法具有較高的潛在成瘤風險,但因其操作簡便,在臨床前實驗中可進行相關探索性研究。 據報道,基因修飾后的BM-MSCs 治療AD 的副反應和成瘤能力可能高于單純的BM-MSCs 細胞;因此,對其安全性進行充分驗證將是后續研究工作的重點之一。 另外,導入目標基因的BM-MSCs 所處的代數會相應增加,干細胞的干性特征、生長特征以及分泌特征等會受到影響,在實踐中應予以充分驗證和考量。

Garcia 等[25]在過表達 VEGF 的 BM-MSCs 治療APP/PS1 小鼠的實驗中發現,治療6 月齡AD 小鼠模型,潛伏期 WT ≈ AD (VEGF-BM-MSCs) < AD(BM-MSCs)

2.3 BM-MSCs 源外泌體治療AD 動物模型

近年來,作為脫細胞治療手段,源于干細胞的囊泡外泌體引起學者的廣泛關注。 外泌體由磷脂雙分子層包繞可溶性物質組成的復雜混合內容物構成,直徑為30~150 nm[32]。 由于其可攜帶多種生物活性物質(蛋白質、DNA 和RNA 等),通過膜融合或內吞作用被受體細胞攝取,穿過血腦屏障,作用于神經元及其微環境中的多種細胞[33]。 外泌體攜帶的多種生物活性物質,可參與機體正常的生理功能及多種疾病的病理進程[29]。 因此,外泌體可規避傳統BM-MSCs 應用中的局限性,外源性分離或者修飾外泌體內容物有望成為理想的“脫細胞”治療手段。

Perets 等[34]在AD 小鼠注射了分離自 MSCs 的外泌體,24 h 后,實驗人員觀察發現外泌體具有向神經損傷區域遷移和歸巢的能力,該功能與神經免疫反應的趨化能力密切關聯。 Reza-Zaldivar 等[35]發現來源于MSCs 的外泌體可增強神經的可塑性,減緩Aβ 誘導的AD 小鼠認知障礙,進一步實驗發現外泌體激活了SVZ 區的神經元生成,減少Aβ 淀粉樣蛋白的沉積。 Xin 等[36]將從BM-MSCs 中超速離心分離的外泌體移植入中風的大鼠模型中,發現BM-MSCs 神經損傷得到緩解,這些外泌體中包含可以促進Aβ 蛋白降解的血清胱抑素C(Cystatin C)。外泌體還可通過將Aβ 轉運至小膠質細胞的溶酶體中促進Aβ 清除;此外,外泌體能夠通過釋放腦啡肽酶/miRNA/鞘磷脂激活蛋白等多種方式營養神經元[37-40],從而改善認知功能。 Nakano 等[41]發現BM-MSCs 來源的外泌體可轉移入損傷的神經元和星型膠質細胞。 多項研究發現外泌體攜帶的多種活性物質,尤其是小RNA(MicroRNA, miRNA),在調控靶基因表達,增進治療效果方面有重要作用[42]。

BM-MSCs 在移植治療中可能出現細胞排斥和血栓形成等風險,但其衍生的外泌體有如下優勢:(1)體積較小,可通過血腦屏障,生物利用率高;(2)便于改造,使其大量攜帶目標的治療效應因子;(3)可通過改造膜表面的受體-配體,定向某類細胞,靶向給藥;(4)可通過靜脈常規性給藥,為藥物研發提供了便利;(5)其納米級尺寸,在給藥中降低了微血管血栓形成的可能性[43]。

盡管外泌體在AD 的診斷和治療中優勢顯著,但將其應用于臨床仍有諸多問題需要解決,包括:(1)精確誘導細胞分泌含特定物質的外泌體的機制和方法尚未明確;(2)如何最大效率地將生物活性物質加載到外泌體中;(3)如何使外泌體選擇性地靶向細胞并精確釋放其內容物;(4)應用外泌體治療的生物安全性也需要進一步的明確;(5)如何簡便的獲得大量外泌體。 綜上,外泌體在AD 治療中的作用及其機制的研究將為阿爾茲海默病的診斷和治療提供新的方向。

3 BM-MSCs 治療阿爾茲海默病模型小鼠的展望

BM-MSCs 用于AD 的模型小鼠治療已經有數十年的歷史,積累了大量的經驗。 數據顯示BM-MSCs可緩解多種 AD 模型小鼠認知功能障礙,但 BMMSCs 應用于臨床還需要克服諸多問題,主要包括以下幾個方面:(1)規范移植細胞/外泌體使用方案:目前大量的臨床前期研究中,細胞/外泌體的質量要求和數量使用比較混亂,缺乏統一標準。 隨著大量BM-MSCs 研究的開展,應制定統一的指導方案,既有助于多項研究的橫向比較,為臨床試驗開展提供可靠的數據支撐,也會避免不必要的重復和浪費。 (2)確定干細胞輸送到目標腦區的給藥方式:目前治療AD 動物模型的給藥方式包括腦立體定位注射和尾靜脈注射兩種,其中動物實驗中以腦立體定位注射海馬區居多,在功能區達到較高的細胞濃度,用于探索BM-MSCs 的治療效果。 該種方法為損傷性操作,一般單次治療,在臨床應用中有一定的局限性。 此外,研究者通過尾靜脈多次注射BM-MSCs 治療AD 小鼠模型,也可在一定程度緩解AD 小鼠癥狀,但該方法的優化和療效收益需要進一步實驗驗證和評估。 近期,Santamaria 等[44]發現鼻腔內移植的MSCs 分泌物也可以緩解AD 小鼠的認知障礙,該方法是一種非侵入性方法,且可多次吸入給藥,損傷較小,但文獻報道較少,可作為新的備選方法在科學實踐中確定其有效性和穩定性;(3)進一步評價BM-MSCs 使用安全性:干細胞治療的安全性是和有效性同等重要的問題,有研究發現胚胎干細胞治療帕金森病時,多只大鼠死于干細胞形成的腫瘤,因此,包括BM-MSCs 在內的干細胞治療應該對于潛在的危險性充分論證,才能應用于臨床實踐[45-46]。 盡管BM-MSCs 走向臨床還有一段距離,隨著其治療AD 的機制進一步被披露,安全性得到進一步驗證,以及實驗條件的日益成熟,BM-MSCs定將為MSCs 治療AD 和其他神經系統疾病的治療做出巨大的貢獻。