膿毒癥急性肺損傷的發生機制及治療研究進展

張宇，盧笑暉，連新寶

山東中醫藥大學附屬醫院急診/重癥醫學科，濟南 250014

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是機體在嚴重感染、休克及創傷等情況下，肺毛細血管內皮細胞及肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cell，AEC)損傷造成的非心源性肺水腫，臨床主要表現為進行性的低氧血癥及呼吸困難。ALI在重癥監護病房最常見，一項流行病學調查納入了我國44個重癥監護病房的2322例膿毒癥患者，結果顯示68.2%的膿毒癥患者合并ALI，90 d病死率達35.5%[1]。即使是好轉出院的患者，在隨后的兩年甚至更長時間里，仍然繼續遭受著危重病后遺癥帶來的痛苦，包括運動受限、心理后遺癥、生活質量下降及經濟負擔等[2]。膿毒癥ALI的病理變化主要包括早期炎性滲出、亞急性期組織化增生及晚期纖維化三個階段[3]。經有效治療后，大多數患者可出現炎癥的消退及水腫的緩慢吸收即前兩個階段的表現[4]。如不進行早期干預，進展至膿毒癥休克期時，肺組織灌注逐漸減少，肺毛細血管收縮，肺通氣/灌注失衡加重，往往會對臟器造成不可逆的損害，甚至引起死亡[5]。膿毒癥ALI的發病機制主要是血管內皮損傷、肺泡上皮損傷，對其治療也主要從減輕血管內皮損傷及保護肺泡上皮并促進修復兩方面開展。本文主要對膿毒癥ALI的發病機制及治療研究進展進行綜述。

1 膿毒癥ALI的發病機制

1.1 血管內皮損傷的機制 膿毒癥患者發生ALI時，多個分子相互作用以復雜的方式損傷肺血管內皮。血管內皮完整性是由血管內皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)與內皮受體激酶(Tie2)協同作用建立的，并受血管內皮蛋白酪氨酸磷酸酶(VE-PTP)的調控[6]，內皮反應元件結合蛋白(CREB)對VE-cadherin的轉錄及形成至關重要[7]。血管內皮細胞連接的穩定性是由產生張力的肌動蛋白細絲及產生拉力的肌動蛋白應激纖維共同決定的，二者在生理狀態下保持著動態平衡[8]。膿毒癥ALI還可引起肺、腎、肝組織微血管滲漏，組織中Angpt1(Ang1)、Tek(Tie2)、KDR(VEGFR2或Flk-1)基因表達下調，這些變化與上述基因上RNA聚合酶Ⅱ密度的降低有關，以肺組織中的反應最明顯[9]。內皮細胞損傷還涉及炎癥反應、細胞焦亡、氧化應激、細胞凋亡及自噬等多種途徑。

1.1.1 炎癥反應 細菌內毒素脂多糖(LPS)是導致膿毒癥ALI急性炎癥的主要刺激因子。LPS誘導膿毒癥動物模型最為常用，微生物LPS通過輔助蛋白，如脂多糖結合蛋白(LBP)及分化簇14(CD14)與先天免疫細胞中由髓樣分化蛋白2(MD2)及Toll樣受體4(TLR4)組成的表面受體復合物結合。脂多糖TLR4/MD2復合物激活下游促炎信號通路，包括核因子-κB(NF-κB)激活多種促炎細胞因子的過度釋放，導致急性細胞和(或)器官損傷，形成膿毒癥ALI[10]。

1.1.2 細胞焦亡 全身暴露于LPS會導致嚴重的內皮細胞焦亡。這種焦亡由半胱氨酸蛋白酶(Caspases)家族介導，相關的蛋白有Caspase-1、4、5、11[11]。活化的Caspase-1切割Gasdermin D，使其形成Gasdermin D的N端或C端，Gasdermin D的N端與細胞膜上的磷脂蛋白結合，形成孔洞并將大量炎性因子釋放到細胞外。Gasdermin D作為焦亡的直接執行蛋白，在血管內皮細胞損傷中起關鍵作用[12]。

1.1.3 氧化應激 氧化應激在膿毒癥ALI中的作用已有較多文獻報道。膿毒癥炎癥反應過程中釋放了大量細胞因子及炎性細胞，通過氧化應激反應產生大量的活性氧自由基(ROS)，破壞細胞的結構及功能，尤其是可損傷線粒體功能[13]。核因子E2相關因子2(Nrf2)在細胞的防御與保護中起重要作用，具有抗氧化應激、抗炎及抑制細胞凋亡等作用。對膿毒癥動物模型的研究發現，蛋白與C-激酶1(PICK1)可通過影響肺胱氨酸/谷氨酸轉運體底物特異性亞單位XCT來調節肺血管內谷胱甘肽的合成，其機制是抑制Nrf2的激活[14]。

1.1.4 細胞凋亡及自噬 在膿毒癥ALI血管內皮損傷過程中，自噬與凋亡處于一種對抗關系，Bcl-2家族蛋白是自噬與凋亡之間交互作用的調節因子。動物實驗研究證實，經LPS處理后肺血管內皮細胞及肺組織細胞凋亡增加，吞噬功能增強，Bcl-2表達降低，Bad表達增加，PINK1/Parkin信號通路激活，而Bcl-2過表達及Bad基因敲除均可減輕LPS誘導的損傷，抑制細胞凋亡及有絲分裂，提高存活率；膿毒癥可抑制肺組織中Beclin-1蛋白的表達，但不抑制Beclin-1 mRNA的表達，是典型的自噬激活[15]。

1.2 肺泡上皮損傷的機制 肺泡上皮細胞(AEC)由肺泡Ⅰ型(AT-Ⅰ)細胞及肺泡Ⅱ型(AT-Ⅱ)細胞組成。除氣體交換外，肺泡液(AFC)的清除也是AEC的主要功能，AFC清除率與鈉離子在肺泡上皮中通過頂端的上皮鈉通道(ENaC)及基底外側Na-KATPase的主動轉運有關[16]。膿毒癥ALI早期，肺泡基底膜發生局灶性破壞及剝脫，但細胞形態不發生變化，僅表現為上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)及β-連環蛋白(β-catenin)連接上的改變[4]。隨后，肺血管內皮的通透性增加，液體及蛋白質聚集在肺間質內引起水腫，此時肺泡上皮的正常緊密屏障受損，隨后水腫液被轉移到肺泡內，其內包含的中性粒細胞數量及炎性趨化因子的激活程度與AEC損傷及ALI的嚴重程度密切相關[4]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路在損傷過程中發揮重要作用，p38 MAPK通過激活Caspase-3及Caspase-7介導AEC的凋亡[17]，死亡相關蛋白激酶1(DAPK1)是一種促凋亡的鈣調蛋白調節的絲氨酸/蘇氨酸激酶，也參與了該過程[18]。在動物模型中AEC的脂肪酸氧化(FAO)明顯受損，這種細胞的代謝缺陷可能是由于參與FAO及線粒體生物能量生成的關鍵介質[如過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α (PGC-1α)、肉毒堿棕櫚酰基轉移酶1A(CPT1A)及中鏈酰基輔酶A(MCAD)]表達降低，使細胞處于易凋亡狀態[19]。適度的自噬可保護細胞免受各種損傷，但過度的自噬尤其是在發病初期AT-Ⅱ細胞的自噬，則是ALI發生的主要原因之一，其潛在分子機制尚待進一步研究[20]。

2 膿毒癥ALI的干預治療

2.1 減輕血管內皮損傷 炎癥反應是肺血管內皮細胞損傷的主要原因，并與細胞焦亡、自噬及氧化應激等多個途徑相互交錯，TLR4介導的炎癥信號通路也參與其中，因此，早期抑制炎癥反應及保護血管內皮對膿毒癥ALI的治療尤為重要。

2.1.1 抑制炎癥反應 從人臍血中分離的無限制體細胞(USSCs)[21]及口服非肽B1受體拮抗劑(BI113823)[22]均可抑制促炎細胞因子TNF-α、IL-6及抗炎細胞因子IL-10的水平，明顯提高嚴重膿毒癥大鼠的存活率，內源性子宮珠蛋白作為內源性抗炎信號在早期的ALI中也起到相似作用[23]。橋蛋白(OPN)是一種由免疫反應細胞產生的分泌型糖蛋白，在多種炎性疾病中起負面作用，經抗橋蛋白抗體(OPN Ab)處理的動物肺組織促炎細胞因子及趨化因子的mRNA及蛋白表達明顯降低[24]，提示OPN也可能是治療膿毒癥ALI的潛在靶點。生長停滯及DNA損傷誘導蛋白34(Gadd34)的主要作用是調節內質網應激反應及細胞凋亡，體外實驗表明，Gadd34可通過去磷酸化IKKβ抑制巨噬細胞產生促炎細胞因子，減輕LPS誘導的膿毒癥及急性組織損傷[25]，而Gadd45β基因敲除(KO)膿毒癥小鼠的早期肺細胞凋亡率明顯增高，IL-1β、IL-6、IL-10及TNF-α等炎性因子表達明顯升高，提示Gadd45β也具有肺保護作用[26]。瓜氨酸組蛋白H3(CitH3)參與了內皮細胞骨架的形成。有研究將最新研制的一種CitH3單克隆抗體用于靶向肽基精氨酸脫亞胺酶(PAD)2及PAD4產生的CitH3，發現其可減輕炎癥反應，緩解ALI[27]。作為最具代表性的抗炎藥物，糖皮質激素的使用一直備受爭議。最新的一項雙盲、單中心隨機對照試驗(RCT)結果顯示，氫化可的松可明顯改善早期膿毒癥ALI患者的氧合指數及臨床癥狀，但并不能改善患者的預后，其不良反應主要是血糖升高，但高血糖并不對預后產生影響[28]。動物實驗表明3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑(他汀類)能減輕肺損傷小鼠的炎癥反應，臨床研究也進一步證實辛伐他汀可通過降低肝素結合蛋白水平而改善患者預后[29]。但另一項臨床RCT研究卻顯示瑞舒伐他汀并不能改善膿毒癥ALI合并高炎癥指標患者的預后[30]。

2.1.2 抑制TLR4介導的炎癥信號通路 TLR4是一種表達于免疫細胞表面的先天免疫受體，其介導的信號通路參與了機體多種炎癥反應。動物實驗表明，多肽-金納米顆粒雜化香煙煙霧提取物[31]、烏苯美司衍生物LYRM03[32]可通過抑制巨噬細胞中促炎性介質及MyD88依賴的TLR4信號轉導通路，減輕其下游的炎癥反應，有助于自噬誘導及隨后的抗氧化蛋白表達，能有效減輕LPS誘導的ALI。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(NOX2)可抑制LPS誘導的膿毒癥大鼠細胞因子表達、TLR通路信號轉導及肺泡重塑，在新生兒膿毒癥小鼠模型中同樣有效[33]。靶向MD2的抑制劑阻斷了TLR4信號通路的傳導，可能是抑制急性炎癥的潛在藥物[34]。肉桂酰胺衍生物中有一種新的MD2抑制劑在體外可阻斷LPS誘導的MD2/TLR4促炎信號的激活，減輕炎癥反應[35]。有研究在分析黃腐酚與MD2分子對接的基礎上，設計合成了39個含5碳連接鏈的雙芳基-1，4-二烯-3-酮類化合物作為MD2抑制劑，可用于開發針對MD2的抗炎藥[36]。姜黃素衍生的新型MD2抑制劑MAC17及MAC28的抗炎活性最強，對LPS刺激的巨噬細胞分泌細胞因子的抑制率達90%，具有肺保護作用[37]。

2.1.3 保護血管內皮 研究顯示，p110γ在膿毒癥ALI患者肺血管內皮細胞中的表達減弱，提示p110γ-FOXM1血管修復信號通路受損是肺血管內皮損傷及滲出液形成的關鍵因素，激活p110γ-FOXM1內皮細胞再生可能是修復血管的一種新策略[38]。糖酵解是內皮細胞(ECs)的主要生物能量途徑，糖酵解激活劑PFKFB3在LPS處理的人肺動脈內皮細胞(HPAECs)及LPS攻擊的小鼠肺內皮細胞中的表達及活性均明顯增加，而內皮特異性PFKFB3基因敲除小鼠表現為內皮通透性降低、肺水腫減輕、存活率增高，提示抑制糖酵解具有肺保護作用[39]。研究顯示，經雌激素相關受體(ERR)α的反向激動劑XCT-790處理的大鼠肺微血管內皮細胞(PMVECs)暴露于LPS后，內皮細胞通透性增加，緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、JAM-A及VE-cadherin表達降低，而ERR的下調進一步加重了這些作用，沉默ERR基因也加劇了LPS誘導的炎性因子產生及NF-κB p65表達的增加，提示ERR作為一種新的負性調節因子在膿毒癥ALI中發揮重要作用[40]。研究表明，重組人血栓調節蛋白可減輕肺毛細血管內皮細胞糖萼的損傷，與保留內皮細胞特異性分子1及硫酸乙酰肝素6-O-磺基轉移酶1(內皮糖萼成分)的基因表達有關[41]，而巨噬細胞衍生的脂質介質MCTR1則可通過ALx/SIRT1/NF-κB/HPA途徑減輕內皮細胞糖萼損傷，保護血管內皮[42]。

2.2 保護肺泡上皮并促進修復

2.2.1 保護肺泡上皮 A2B腺苷受體(A2BAR)具有保護AEC及減輕肺水腫的作用。一方面A2BAR通過抑制MAPK信號通路介導的線粒體凋亡途徑減輕AEC損傷[17]；另一方面，A2BAR通過激活腺苷酸環化酶刺激cAMP的形成，促使ENaC提高AFC清除率，從而減輕肺水腫[43]。褪黑素也被證實可通過激活SIRT1/SGK1/Nedd4-2途徑提高ENaC介導的AFC清除率，是一種新的治療策略[44]。miR-34a是一種多功能調節劑，參與細胞增殖、凋亡、生長及自噬，可作為保護性因子抑制FoxO3表達，抑制AT-Ⅱ細胞過度的自噬活性，減輕對肺屏障的破壞[45]。

2.2.2 促進AEC修復 一旦AEC開始損傷，細胞將啟動修復程序，該過程可能持續2~14 d，由于AT-Ⅰ細胞占肺泡上皮面積的95%以上，所以產生新的AT-Ⅰ細胞對于肺泡上皮修復至關重要，AT-Ⅱ細胞作為祖細胞可通過增殖分化形成AT-Ⅰ細胞，在嚴重損傷時，分泌細胞、支氣管肺泡干細胞及角蛋白-5表達(KRT5+)細胞等均可替代祖細胞[46-47]。KRT5+細胞的增殖由缺氧誘導因子(HIF)-Notch及纖維細胞生長因子受體2信號轉導驅動[48]，AT-Ⅱ細胞的增殖受Wnt-β-Catenin誘導，并被Notch及HIF79抑制[49]。FGF10-FGFR2B信號是維持AT-Ⅱ細胞必需的，可以在肺損傷后產生基底細胞，并通過支氣管上皮干細胞促進AEC的再生[50]。Hippo-YAP信號通路通過磷酸化負調節其下游效應物YAP的轉錄活性，磷酸化的YAP在維持細胞增殖及凋亡穩態中起重要作用，還可調節AT-Ⅱ細胞的增殖[51]，同時YAP/TAZ蛋白也參與AT-Ⅱ向AT-Ⅰ分化[52]。黏著斑激酶(FAK)是一種細胞質蛋白酪氨酸激酶，通過FAK-PI3K-Akt途徑促進了AEC的增殖及遷移，并阻止細胞凋亡，恢復肺泡的完整性[53]。隨著干/祖細胞研究的進展，靜脈輸注骨髓間充質干細胞(MSCs)治療膿毒癥ALI的第1階段臨床試驗顯示患者耐受性良好[54]。有研究表明角質細胞生長因子(KGF)在ALI中可能是有益的[55]，但一項隨機、雙盲、安慰劑對照的第2階段研究結果顯示，KGF并不能改善患者的生理或臨床結果，甚至可能是有害的[56]。

2.2.3 外泌體在AEC損傷修復中的作用 外泌體的直徑為50~150 nm，是多囊泡核內體與母細胞胞膜融合后釋放至胞外形成的，其內包含脂質、蛋白、受體、mRNA、lncRNA等成分，是細胞間信息傳遞的重要橋梁，目前已成為研究的熱點。研究顯示，MSCs分泌的外泌體包含MicroRNA-377-3p，后者可以通過靶向RPTOR調節自噬，抑制炎性因子，促進肺損傷的恢復[57]；而其包含的MicroRNA-30b-3p可下調SAA3的表達，從而減輕LPS誘導的AT-Ⅱ細胞損傷[58]。

2.2.4 機械通氣與膿毒癥ALI 呼吸機不能治療膿毒癥ALI，而是為肺屏障的修復及藥物發揮作用爭取時間。小潮氣量、高呼氣末正壓(PEEP)的保護性通氣策略是目前常用的方案，推薦使用初始小潮氣量(6 ml/kg)。研究表明，初始潮氣量每增加1 ml/kg，ICU死亡風險增加23%，與初始潮氣量比較，隨后的潮氣量每增加1 ml/kg，死亡風險增加15%[59]。另一項研究顯示，即使是保護性的通氣策略，也可能會加重肺損傷[60]。既往曾報道高頻振蕩通氣(HFOV)可以減少這種二次損傷發生，但研究發現其并不能降低30 d病死率[61]。更先進的通氣模式，如氣道壓力釋放通氣(APRV)、使用時間控制的適應性通氣(TCAV)方案可減輕肺損傷，其可能的機制包括改善肺泡不均勻性膨脹，減少肺泡、肺泡毛細血管的微應變及應力升高，減少肺泡潮氣量，以及通過對抗腹內壓的增加來調節胸腔內的壓力[62]。

3 總結與展望

血管內皮損傷和肺泡上皮損傷可從整體上概括膿毒癥ALI的發病機制，但這其中包含了復雜的分子機制，尚待進一步研究證實。在治療上，通過動物實驗發掘潛在的抗炎藥物的研究居多，臨床試驗相對較少。潛在的治療藥物從發現到臨床應用是一個漫長的過程，部分動物實驗研究提示有效，但臨床試驗卻得到了相反的結果[29-30,56]。多途徑靶向細胞移植(如間充質基質細胞)[56]及更優化的呼吸機通氣模式[62]有望成為新的治療選擇，但仍須進一步臨床研究進行驗證。