牙齦卟啉單胞菌對不同組織來源血管內皮細胞的作用及機制的研究進展

雷雙 庾靖君 唐曉琳

1.中國醫科大學口腔醫學院·附屬口腔醫院兒童口腔科 遼寧省口腔疾病重點實驗室 沈陽110001；2.中國醫科大學口腔醫學院·附屬口腔醫院牙周病科 遼寧省口腔疾病重點實驗室 沈陽110001

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是重要的牙周可疑致病菌，是1 種革蘭陰性專性厭氧桿菌，在牙周組織附著嚴重喪失部位、深牙周袋部位檢出率較高。根據第四次全國口腔流行病學調查報告，牙周病作為口腔中常見病、多發病，發病情況呈現上升態勢[1]。現有研究發現，P.gingivalis不僅與牙周病密切相關，而且與動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）[2]、阿爾茲海默病（Alzheimer's disease，AD）[3]、帕金森疾病（Parkinson's disease，PD）[4]等多種全身性疾病關系密切，可能是加重疾病發生發展的重要原因之一[5]。根據全基因組關聯分析（genome?wide association study，GWAS）研究，P.gingivalis感染條件下的失調宿主基因在AD 等認知障礙疾病、糖尿病、心血管疾病等宿主基因中富集；此外，牙周炎組織或P.gingivalis感染巨噬細胞中失調基因與AD海馬組織或粥樣硬化斑塊中的失調基因相類似，說明牙周炎可能是全身疾病的致病因素之一[6]。有學者[7]采用多種口腔致病菌共同感染Toll 樣 受 體（Toll like receptors，TLR） 2?/?和TLR4?/?雙敲除小鼠后，發現在心臟、腎臟、肺、動脈等器官中檢測到口腔致病菌基因組DNA，提示口腔致病菌可以向全身組織器官內播散。

血管內皮細胞（endothelial cells，EC）位于血管內壁，有利于血流移動，血小板功能及免疫功能。微生物利用宿主循環系統在體內循環，通過EC 進出血流。細菌等危險因素暴露可損傷內皮細胞的防御機制，導致血管內皮細胞完整性破壞，引起血管內皮細胞功能失調[8]，同時，內皮細胞中的某些基因將被激活并改變細胞的功能特性[9]。病原菌會促進EC 衰老、凋亡并干擾其生物學屏障。本文就P.gingivalis 對不同組織來源血管內皮細胞的可能作用及機制作一綜述。

1 P.gingivalis對外周心血管EC的作用研究

心血管疾病是一系列由遺傳和環境共同作用而引起的多因素慢性炎癥性疾病。根據世界衛生組織的定義，心血管病是心臟和血管疾患引起的，包括冠心病、腦血管疾病、高血壓、周圍動脈血管疾病、風濕性心臟病、先天性心臟病和心力衰竭。應用核酸及抗原檢測方法在人類AS斑塊中已鑒定出多種病原體，包括肺炎衣原體、幽門螺桿菌、腸桿菌及多種口腔致病菌如P.gingivalis等，提示細菌可能是參與AS 的重要致病因素之一[10]。在動物實驗中發現，應用P.gingivalis脂多糖（li?popolysaccharide，LPS） 感 染 載 脂 蛋 白E 基 因（ApoE?/?）敲除小鼠構建疾病模型，發現由重度牙周病誘發的系統性炎癥會加速AS的形成，誘發內皮細胞功能紊亂并激活巨噬細胞[11]。以上結果說明，P.gingivalis感染與AS 關系密切，P.gingivalis與血管內皮細胞相互作用是AS斑塊形成和內皮細胞功能紊亂的重要病理基礎。

1.1 P.gingivalis與EC相互作用的毒力因子

P.gingivalis是牙周病的主要致病菌，其菌毛、莢膜多糖、LPS、膠原酶、牙齦蛋白酶、凝血素、脂蛋白等會損傷血管內皮細胞功能，誘發炎癥反應，從而引起AS。細菌菌毛蛋白fimA 作為細菌表面主要毒力因子，有學者[12]檢測AS 斑塊樣本中不同fimA 基因型，發現fimA Ⅳ型、Ⅱ型檢出率明顯高于其他類型。LPS 作為P.gingivalis主要毒力因子，可通過調節肌動蛋白激酶1/2途徑激活血管內皮細胞誘導血管生成[13]。有學者[14]將人冠狀動脈內皮細胞（human coronary artery endothelial cells，HCAEC）分別持續暴露于P.gingivalis及其毒力因子LPS 中，發現其誘發促炎因子及血管緊張素Ⅱ的形成，從而導致內皮功能紊亂，可能是AS 發生、發展的原因。另外，P.gingivalis脂蛋白[15]、牙齦蛋白酶[16]、血凝素A（hemagglutinin A，HagA）[17]等參與其對內皮細胞的黏附和侵入過程，加速AS發病過程。

1.2 P.gingivalis對EC的黏附和侵入

細菌對EC 的黏附及侵入在細菌致病過程中具有重要意義，細菌的致病前題是其黏附于特定組織表面。P.gingivalis侵入人臍靜脈的內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）系中，誘導核苷酸結合的寡聚糖結構域過表達，促進血管細胞黏附分子1（nucleotide?binding oli?gomerization domain 1，NOD1）及細胞間黏附分子表達，沉默NOD1 后抑制NF?κB 通路，在細菌侵入EC 中發揮重要作用[18]。巨噬細胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）在P.gingivalis入侵EC中促進黏附分子1表達。內皮細胞表達MIF，誘導的促AS 病損形成[19]。另有研究發現，P.gingivalis可表達多種血凝素作為毒力因子參與對內皮細胞的黏附及侵入，HagA 可黏附、侵入HCAEC及牙齦上皮細胞（gingival epithe?lial cells，GEC）等多種細胞[17]。還有研究發現，P.gingivalis通過CD74/CXCR4 受體復合體調控單核內皮細胞黏附過程[20]。但具體作用機制仍需進一步探究。

侵入是細菌致病并使其深入內部的另一種重要方式。牙齦蛋白酶在P.gingivalis侵入多種細胞中均發揮重要作用[16,21?22]。P.gingivalisW83 侵入冠狀動脈內皮細胞時，脂蛋白PG0717表達升高，同時PG0717缺失可降低牙齦蛋白酶的活性，說明其可能參與P.gingivalis的毒力作用，參與內皮細胞中P.gingivalis的清除和感染控制[15]。研究發現，P.gingivalis381能夠入侵內皮細胞，細菌避開了溶酶體的內吞途徑，而是在自噬體中存在，持續影響內皮細胞從而形成慢性感染可能會加劇沿血管部位的免疫應答[23]。近年來研究發現，相比于使用細菌毒力因子，直接采用細菌侵入對內皮細胞損傷更大。學者應用不同菌株P.gingivalis（W83、A7436、381、33277）感染ApoE?/?AS 小鼠，評估其對人冠狀動脈內皮細胞侵襲、黏附能力，發現W83、A7436、381 侵襲能力強于33277，說明不同菌株對內皮細胞的侵襲作用及其潛在機制存在差異[24]。

1.3 P.gingivalis促進EC凋亡

正常血管壁存在少量的細胞凋亡，對維持血管的正常發育必不可少，而AS時則會出現異常活躍的血管內皮細胞凋亡[25]。將牛冠狀動脈內皮細胞（bovine coronary artery endothelial cell，BCAEC）暴露于牙齦蛋白酶中，會導致細胞黏附降低并且凋亡增加，并與不同水平的半胱氨酸依賴蛋白水解活性相關[16]。由P.gingivalis提取的蛋白酶樣物質可誘導主動脈內皮細胞凋亡，可能機制為破壞微管蛋白及整合素β1、降低ERK1/2 蛋白激活[26]。Hirasawa等[27]發現，P.gingivalis感染HUVECs誘導內質網應激介導的細胞凋亡，隨后自噬反應保護其細胞凋亡的影響，從而影響血管系統AS 的發生。

1.4 P.gingivalis誘導EC炎癥反應

AS 作為一種慢性炎癥性疾病，致炎因子在AS 的發病進程中發揮了重要的炎癥調節作用。P.gingivalisfimA 通過上調gp130 表達，可誘導HUVECs 自分泌調節白細胞介素（interleukin，IL）?6，誘發炎癥反應[28]。選擇素E 作為表面蛋白，參與調控P.gingivalis對HUVECs 黏附作用，并激活胞外分泌，可能激活血管炎癥反應[29]。Suh等[30]發現，P.gingivalis?LPS 可以促進全身炎癥反應和AS斑塊形成；P.gingivalisLPS通過上調內皮細胞黏附分子的表達，從而增加單核細胞對內皮細胞的黏附，并促進巨噬細胞產生炎癥因子。

2 P.gingivalis對腎小球內皮細胞的作用研究

慢性腎病（chronic kidney disease，CKD）是1種嚴重危害人類生命健康的常見慢性疾病。流行病學調查顯示具有逐年升高趨勢[31]。相比之下，CKD 人群罹患牙周病的風險更高[32?33]，并且牙周病亦對CKD 的發生發展產生影響[33?34]。目前，很難確定牙周病在CKD致病機制中的具體作用。EC作為腎組織內主要組成部分，研究表明EC 損傷可能是細菌及其毒性產物引起宿主免疫反應的重要機制。

目前，針對P.gingivalis對腎小球血管內皮細胞的研究較少。Harada 等[35]應用P.gingivalis?LPS刺激小鼠腎臟，檢測其基因表達譜，發現在5 個功能性基因差異表達，同時，體外實驗中在腎小球內皮細胞也證實以上基因表達上調。以上結果提示，P.gingivalis?LPS 刺激后腎組織內基因改變主要來源于腎內皮細胞，以上基因可能與CKD 的發病機制相關。Sawa 等[36]也發現，血液中TLR 受體誘導腎小球內皮細胞產生腫瘤壞死因子?α、IL?6等炎癥因子，導致腎小球硬化癥，提示P.gingivalis?LPS 在糖尿病腎病中發揮重要作用。Kajiwara等[37]發現，在Ⅰ型、Ⅱ型糖尿病中腎小球內 皮 細 胞 表 面 存 在TLR?2 及TLR?4 受 體，P.gingivalis?LPS 可降低糖尿病小鼠的生存率，其誘導糖尿病腎病主要依賴于腎小球內皮細胞中TLR2受體。

3 P.gingivalis對腦微血管內皮細胞的作用研究

血腦屏障（blood?brain barrier，BBB）位于中樞神經系統實質內，由腦微血管內皮細胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）及其細胞間的緊密連接、基底膜、及星形膠質細胞組成，調節離子、氧氣及營養物質在血液和腦實質之間的交換。BBB 是外周微生物進入顱內的第1 道屏障。有學者[38]認為，BBB 干擾是AD 的早期指標，BBB功能受損有利于微生物進入中樞神經系統內。流行病學調查結果顯示，慢性牙周炎患者患AD、PD 的危險因素更高，臨床癥狀更顯著[39?40]。實驗研究發現，P.gingivalis及其毒力因子誘發腦內炎癥反應能夠產生中樞神經損害，從而促進疾病發展[41?42]。P.gingivalis可通過多種途徑進入腦內，其主要途徑為：1）感染巨噬細胞[43]；2）通過感染顱神經進入腦內（例如嗅覺神經）[44]；3）直接感染損傷BBB 中內皮細胞[45]。但目前對P.gingivalis如何影響BBB 及BMECs 功能研究較少。現有研究顯示，慢性P.gingivalis感染可加速ApoE?/?小鼠腦組織中顆粒沉積，并且在腦毛細血管內可見廣泛IgG 分布，免疫組化染色可見BBB 損傷，提示損傷的BBB 可能加重炎癥反應從而加速老年鼠腦組織中顆粒沉積[46]。在P.gingivalis感染ApoE?/?小鼠大腦中發現，神經母細胞瘤細胞系表面膜結合的CD14受體脫落，內皮細胞之間緊密連接蛋白缺失，內毒素滲透通過BBB，導致腦組織暴露于炎癥介質中[5]。有學者[47]認為，對于ApoE?/?小鼠大腦，BBB 完整性受損可能是實驗誘導腦內組織損傷的繼發因素。但目前，對于中樞神經系統BBB 損傷的具體機制仍不清楚。

4 結論

綜上所述，P.gingivalis與外周心血管內皮細胞、BBB、腎小球血管內皮細胞相互作用，進入全身器官組織內從而可能參與AS、AD、CKD 等全身疾病的發生和發展過程。P.gingivalis及其毒力因子致病性在AS及非中樞神經系統血管內皮細胞方面的研究較多，但在BBB 及中樞神經系統血管內皮細胞方面鮮見報道。AD、PD 等神經退行性疾病在老年人中發病率較高，BBB 的病理變化在其中發揮重要作用，因此對于P.gingivalis對內皮細胞的作用及在各類神經系統病變過程中的作用機制應該給予更多的關注。對于P.gingivalis與BMEC 之間的具體作用機制報道較少，將來可通過轉錄組學和蛋白質組學高通量分析，結合生物信息學，篩選P.gingivalis發揮黏附作用的毒力因子及BMECs受體分子，有助于進一步確定細菌與BMECs之間具體作用機制。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。