內質網應激在牙周炎影響全身疾病過程中的作用

李鑫 李艷 丁旭 夏博園 于維先

吉林大學口腔醫院牙周病科 吉林省牙發育及頜骨重塑與再生重點實驗室 長春130021

牙周炎是發生在牙周組織的慢性感染性疾病，是全球最流行的慢性炎性疾病之一，表現為牙齦軟組織和牙槽骨等牙周組織的持續破壞，最終導致牙齒缺失[1]。其發病機制與多種危險因素有關，其中最重要的是牙菌斑中的復雜生物群體和宿主的防御功能。在牙周炎發展進程中，細胞因子同樣發揮重要作用[2]。眾多研究表明，牙周炎可增加全身疾病（阿爾茲海默癥、心血管疾病、糖尿病、高血壓、慢性腎病等）的發生風險[3?7]。

近年來牙周炎組織細胞中細胞器的病理變化受到了學術界的廣泛關注。內質網是內膜構成的封閉的網狀管道系統，是細胞中的重要細胞器，是蛋白質折疊加工、脂類合成及轉運的重要場所。炎癥、氧化應激、缺氧等均可引起內質網的功能障礙[8?10]，進而導致蛋白質折疊異常，通過激活內質網跨膜蛋白肌醇需求酶1（inositol?requiring en?zyme 1，IRE1）、蛋白激酶樣內質網激酶（protein kinase?like endoplasmic reticulum kinase，PERK）和激活轉錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）介導的信號通路引起未折疊蛋白反應（un?folded protein response，UPR），從而緩解內質網壓力，維持細胞穩態。當刺激持續存在時，超過細胞自我調節能力，內質網應激可通過C/EBP 同源蛋 白（C/EBP?homologous protein，CHOP） 途徑導致細胞凋亡。另外，通過內質網應激也可以激活白細胞介素（interleukin，IL）?8、IL?4 和腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）等炎癥因子來介導炎癥的發生[11]。

已有許多臨床證據顯示，在牙周炎病變中，炎癥因子可通過引起未折疊蛋白質的積聚引起內質網應激[12]，從而進一步破壞牙周組織。同時，內質網應激通過介導細胞凋亡，參與了全身慢性疾病的發生發展[13]。本文介紹了內質網應激在牙周炎影響全身性疾病中的作用研究，旨在進一步說明牙周炎對全身疾病影響的機制，為與牙周炎相關的全身疾病的防治提供新的思路。

1 內質網應激

內質網應激是外部刺激使細胞內質網生理功能發生紊亂的亞細胞器病理狀態，表現為內質網腔內錯誤折疊與未折疊蛋白質的積累。內質網將正確折疊的蛋白質轉運至高爾基體，而折疊異常的蛋白質被保留在內質網腔內，通過內質網相關降解作用被逆轉運至細胞質并降解。當未折疊蛋白的積聚超過內質網降解能力時，形成蛋白質聚集體，并激活UPR，緩解內質網應激狀態，維持細胞內穩態；而持續的內質網應激則會觸發IRE1?TRAF2?ASK1 途徑和CHOP 介導的凋亡信號誘導細胞凋亡[14]。不利的局部環境，例如：炎癥、缺氧、Ca2+穩態破壞等，均可引起未折疊蛋白的聚集，導致內質網應激[15]。UPR 包括3 條主要途徑，由內質網膜上3 個蛋白質傳感器激活[16?17]：IRE1、PERK和ATF6。

1.1 IRE1途徑

IRE1 是內質網壓力傳感器，通過感測內質網腔內壓力變化觸發UPR。錯誤折疊蛋白積累時，IRE1 核糖核酸酶通過構象變化，自磷酸化和寡聚化被激活，繼而與調節UPR 相關基因的轉錄因子X?box結合蛋白1（X?box binding protein 1，XBP1）結合，介導信號傳導，通過降解或重折疊內質網腔中累積的錯誤折疊蛋白而緩解壓力。在不可逆內質網壓力下，IRE1α 可介導凋亡啟動子caspase?2的活化，從而觸發細胞凋亡。此外，內質網應激延長時，激活的IRE1 與腫瘤壞死因子受體相關因子2 （TNF receptor?associated factor 2，TRAF2）以及細胞凋亡信號調節激酶1（apoptosis signal?regulating kinase 1，ASK1） 結 合，形 成IRE1/TRAF2/ASK1 復 合物，誘 導c?Jun 氨 基 末端激 酶（c?Jun N?terminal kinase，JNK）磷酸化，進而導致細胞凋亡[18]。

1.2 PERK途徑

PERK 也稱為真核翻譯起始因子2?α 激酶3，是一種蛋白激酶。內質網應激期間內質網分子伴侶BiP與PERK 分離，使其自身磷酸化，繼而使真核翻譯起始因子2α（eukaryotic translation initia?tion factory 2α，eIF2α）磷酸化，并選擇性誘導ATF4，從而選擇性誘導UPR 靶基因表達。當細胞內發生不可逆內質網應激時，ATF4 通過增強CHOP的表達，下調抗凋亡線粒體保護蛋白，即B淋巴細胞瘤?2（B?cell lymphoma?2，BCL?2），上調僅含BH3結構的蛋白質，DNA損傷誘導蛋白34（growth arrest and DNA damage34，GADD34）的表達，促進細胞凋亡[19]。

1.3 ATF6途徑

ATF6 是1 種隱性轉錄因子，在內質網應激時與Bip的結合被破壞，轉運至高爾基體，被高爾基體的2 個位點蛋白酶（S1P 和S2P）裂解，隨后轉運至細胞核，與內質網應激反應原件（endoplas?mic reticulum stress response element，ERSE）結合，誘導編碼內質網伴侶，促進UPR靶基因表達[20]。

2 內質網應激與牙周炎的關系

細胞凋亡參與了牙周炎的病理生理過程，而內質網應激通過CHOP，即GADD153 下調Bcl?2的表達，使細胞對凋亡敏感，從而誘導細胞凋亡[21]。在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）[22]中檢測到PERK、ATF4、CHOP 等內質網相關蛋白的表達，證實了LPS可以誘導PDLSCs發生內質網應激。尼古丁的刺激使牙周膜細胞中內質網應激經典標志物GRP78 上調，調節細胞死亡的其他內質網應激基因（如PERK 和eIF2α）磷酸化，CHOP 上調，誘導牙周組織細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的降解，加劇細胞壞死和牙周結締組織破壞[23]。在牙齦卟啉單胞菌LPS[24]處理后的人牙周膜細胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs） 中C/EBPβ 基 因 表 達 增加，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）表達，促炎細胞因子IL?6 和IL?8 表達上調，PERK 和eIF2α 的磷酸化均顯著上調，GRP78/Bip 和CHOP 的表達增加。這些結果表明，牙齦卟啉單胞菌LPS誘導的內質網應激調節hPDLCs炎癥反應和ECM 的降解。在內質網應激時，PERK?eIF2α?ATF4 途徑被激活，并通過靶向晚期分化中特定成骨細胞標志物影響成骨細胞的存活、增殖和終末分化，從而影響成骨功能[25]。在牙齦卟啉單胞菌誘發的小鼠實驗性牙周炎中[26]，內質網應激通過介導單核細胞趨化蛋白?1（monocyte che?moattractant protein?1，MCP?1）誘導單核細胞分化為破骨細胞（osteoclast，OC）前體細胞，與假手術組相比，牙齦卟啉單胞菌組IL?6，TNF?α，OCs 標記基因和組織蛋白酶K （cathepsin K，CTSK）表達上調，參與牙槽骨的吸收。而內質網應激抑制劑4?PBA則明顯抑制了OC的功能，減少了牙槽骨的吸收。進一步研究表明，4?PBA 抑制了內質網應激誘導的牙齦成纖維細胞死亡和自噬[27]。Xue 等[28]通過體內和體外實驗均證明了牙周炎可以通過內質網應激調節PDLSCs 的成骨能力：IL?1β 和TNF?α 作用于H?PDLSCs 后，UPR 靶基因表達上調，成骨標記蛋白和骨鈣素基因表達及礦化結節形成減少，4?PBA 處理后則結果相反；在SD 大鼠牙周炎模型中，衣霉素（tunicamycin，Tm）組比其他組發生的牙槽骨吸收更多，但Tm聯合PERK 抑制劑給藥后牙槽骨吸收明顯減少。這些研究結果證明牙周炎可以引起內質網應激，內質網應激能進一步促進細胞壞死和牙周組織的破壞，參與牙周炎的發展。

3 內質網應激在牙周炎相關的全身性疾病中的作用機制

牙周炎作為一個潛在的危險因素，可能導致肝臟損傷[29]、糖尿病[30]、動脈粥樣硬化[31]等全身性疾病發病的風險[32]，炎癥反應、炎癥因子的刺激可能是兩種疾病的中介，但具體機制尚不清楚。然而近年來一系列研究表明內質網應激同樣與牙周炎相關的全身系統疾病關聯密切。內質網應激參與了牙周炎對全身系統疾病的作用，但是全身性疾病是否會通過內質網應激影響牙周炎的發展目前尚無結論。

3.1 內質網應激與肝損傷

眾所周知，肝細胞壞死是肝臟疾病的重要因素。在肝損傷過程中，外源性刺激可以誘導內質網應激，引起肝細胞凋亡，進而導致肝損傷。體外研究[33]發現，山奈酚可調節Grp78和CHOP的表達從而影響內質網應激誘導肝細胞凋亡。在牙周炎大鼠模型中[34]可以觀察到中央靜脈周圍出現明顯的脂肪變性，壞死的肝細胞，單核細胞通過油紅O 染色檢測到脂質滴，并且牙周炎組肝細胞脂肪變性的大鼠血清LPS 水平高于同組沒有脂肪變性的大鼠。牙齦卟啉單胞菌是牙周炎的主要致病菌，其產生的LPS 可誘導大鼠非酒精性脂肪性肝炎的發生[35]。Shi 等[36]通過腹腔注射LPS 建立肝損傷模型，并在其中檢測到內質網應激標記物CHOP 表達明顯升高，從而證明持續的內質網應激可以誘導肝細胞死亡，最終導致肝損傷。體內及體外研究[37]均證實，皮卡替諾醇可通過下調CHOP 的表達，減輕內質網應激介導的炎癥，從而緩解LPS 誘導的肝損傷。一系列實驗結果揭示了內質網應激在肝損傷過程中的作用。

3.2 內質網應激與糖尿病

一直以來，內質網應激被認為是2 型糖尿病的發展因素。胰島素是胰腺β 細胞產生的激素，以維持葡萄糖穩定，β細胞分泌胰島素不足可促進糖尿病的發生發展[38]。2007 年，Laybutt 等[39]用棕櫚酸酯處理熱激蛋白5 表達載體轉染的MIN6 細胞，發現真核翻譯起始因子激酶2?α 激酶3 及其真核翻譯起始因子2A 磷酸化降低以及活性XBP1，DNA 損傷誘導轉錄本3 和caspase?3 產生減少，并且在2型糖尿病動物模型和人類2型糖尿病受試者胰島中檢測到內質網應激相關基因的激活，證明內質網應激是β 細胞脂質凋亡的必要條件，有助于2型糖尿病的發展。在牙周炎復合2型糖尿病組大鼠中觀察到胰島結構紊亂，胰島β 細胞數量減少。研究證實了LPS可誘導Bip/GRP78，XBP?1和CHOP 轉錄物的表達，而抑制ATF4，CHOP 的表達可促進胰腺β 細胞的存活[40?41]。Domon 等[42]在牙周炎患者的牙齦活檢組織中檢測到內質網應激時與IRE1 結合的轉錄因子XBP1 表達上調，而腺病毒介導的Xbp1s過表達誘導β細胞凋亡，并且減少胰島素的分泌[43]。IRE1α 激酶可觸發細胞凋亡[44]，進一步導致剩余的β細胞變性，最終導致2型糖尿病。此外，研究證實脂肪組織是胰島素抵抗發生的起始部位和重要的場所。有學者體外培養3T3?L1 前脂肪細胞，并誘導其分化為脂肪細胞，用牙齦卟啉單胞菌LPS 作用于脂肪細胞來模擬牙周炎對脂肪組織的致炎過程，檢測到GRP78、XBP1s表達升高。從而驗證了內質網應激參與了牙周炎介導的脂肪組織炎癥，進而加重胰島素抵抗，揭示了牙周炎與2型糖尿病發生發展的關系。

3.3 內質網應激與心血管疾病

內質網應激還會影響心血管的功能。Liu 等[45]認為內質網應激通過增加GRP78，CHOP 的表達，可以促進內皮細胞凋亡的速率。而Pedruzzi等[46]通過體外實驗證實，內質網應激中IRE1、JNK 等的表達可以促進NADPH 氧化酶4 的表達從而引起平滑肌細胞（smooth muscle cell，SMC）死亡，而IRE1 的沉默可抑制該酶表達，減少了SMC 的死亡。實驗證實內質網應激參與了心臟和血管的病理生理過程，許多調節內質網應激的藥物可以用于治療心血管疾病。在大鼠腸系膜微動脈損傷模型中Chen 等[47]在LPS 刺激的人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）中觀察到內質網應激標志物（GRP78/Bip和CHOP）的水平顯著增加。Hirasawa 等[48]在牙齦卟啉單胞菌感染的HUVEC 中檢測到GADD153，GRP78 和caspase?12 的表達上調，而添加內質網應激抑制劑或抗caspase?12試劑后牙齦卟啉單胞菌誘導的HU?VEC 細胞凋亡明顯降低，初步表明牙齦卟啉單胞菌可引起內質網應激，介導細胞凋亡，增強自噬，從而促進血管的粥樣硬化，引起心血管疾病。為了研究牙周炎是否通過調控內質網應激介導的凋亡影響血管鈣化，有學者建立大鼠動物模型，分為正常對照組、牙周炎組、血管鈣化組及牙周炎?血管鈣化聯合組，結果顯示聯合組中心血管管壁彈性纖維結構不清，Caspase?3、GRP78、GRP94和CHOP 在聯合組中的表達明顯高于正常組。這些結果提示，內質網應激可能是通過CHOP 途徑參與了牙周炎對心血管鈣化的影響。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。