厄貝沙坦對自發性高血壓大鼠的降壓作用及腎臟RAS 基因表達分析

陳思思 薛曉敏 李 毓 朱冰兒 陳力豪 吳 悅 吳人照

1.浙江省中醫藥研究院基礎實驗研究所，浙江杭州 310007；2.浙江中醫藥大學基礎醫學院，浙江杭州 310053；3.浙江中醫藥大學第二臨床醫學院，浙江杭州 310053

全球高血壓患病率在逐年增加，專家預計到2025 年全球高血壓患者將上升達15 億人[1]。最新研究顯示中國成年人高血壓患病率已達27.9%[2]，是我國心腦血管疾病的首要危險因素。高血壓可導致如心肌梗死和腦卒中等致命性心腦血管疾病[3]。據《中國心血管病報告》統計報道[4]，2016 年我國因心血管病死亡例數占比達40%以上，死亡率高于腫瘤及其他疾病，嚴重危害國民健康。針對高血壓治療的藥物一直是臨床關注的重點，目前血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（ARB）、血管緊張素轉化酶抑制劑 （ACEI）、β-受體阻滯劑被JNC8等指南推薦為高血壓的首選用藥[5]。ARB 類藥物主要通過阻斷血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）與受體結合達到抗高血壓的作用，近年來其在臨床抗高血壓治療中應用日益廣泛[6]。厄貝沙坦屬于ARB 類，在輕中度高血壓患者中，因其降壓效果優于氯沙坦和纈沙坦[7]，臨床應用最廣泛。目前尚未了解厄貝沙坦對SHR 大鼠降壓相關的基因表達情況的影響，因此，本實驗以SHR 大鼠為研究對象，觀察厄貝沙坦對SHR 大鼠的血壓作用及ACE2、血管緊張素Ⅱ受體-1（AT1R）和AT2R mRNA 表達的情況，旨在為深入了解高血壓降壓機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

34 周以上（老齡）SHR 大鼠，Wistar 大鼠，雌性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證：SYXK（浙）2019-0010。實驗過程遵循了單位和國家有關實驗動物保護與使用的準則，并經本單位實驗動物倫理委員會批準。

1.2 主要儀器及試劑

日本BP-98A 型無創尾動脈血壓測量儀；美國Thermofisher Nano Drop 2000 核酸蛋白定量儀；美國ABI Step One Plus 熒光定量PCR 儀；厄貝沙坦片購自賽諾菲制藥有限公司；Trizol 試劑、逆轉錄試劑盒（047A）、SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒，均購自寶生物工程（大連）有限公司。上海生工生物工程有限公司設計并合成引物。

1.3 實驗分組

大鼠適應性飼養1 周后測量血壓，將SHR 大鼠隨機分為模型組、厄貝沙坦組，每組6 只，另設6 只Wistar 大鼠為正常對照組。厄貝沙坦臨床上人的常用劑量為150 mg/d，按正常人體重60 kg 計算，劑量為2.5 mg/（kg·d），以人用劑量的6 倍作為大鼠的給藥劑量，即15 mg/（kg·d）。厄貝沙坦組每天灌胃15 mg/kg厄貝沙坦，模型組和正常對照組灌胃等量飲用水，給藥8 周，每周測量1 次給藥3 h 及24 h 的血壓，觀察收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）的波動變化。RT-qPCR檢測腎組織中ACE2、AT1R、AT2R 的表達情況。

1.4 測量血壓

將大鼠置恒溫水浴鍋上預熱，隨環境溫度的變化對加熱時間進行調整，使大鼠尾部血流量充盈便于血壓的測量。連通BP-98A 型無創尾動脈血壓測量儀，并通過配套軟件讀取數據。每只大鼠在清醒安靜狀態下測量6～10 次血壓，其均值為測量所得值。

1.5 相關基因的表達情況

取腎臟組織100 mg，徹底勻漿后用Trizol 試劑提取總RNA 并測定濃度。用逆轉錄試劑盒獲取cDNA，再采用SYBR Green 實時熒光定量PCR 試劑盒檢測腎臟ACE2、AT1R、AT2R mRNA 的表達量。其中PCR反應體系為20 μL，包括SYBG 10 μL，H2O 6 μL，Primer F 0.8 μL，Primer R 0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，模板DNA 2 μL。反應條件為：95℃30 s；95℃、5 s，60℃、30 s，共40 個循環；95℃、15 s，60℃、60 s，95℃、15 s 熔解曲線。基因的引物序列具體見表1。

1.6 統計學方法

運用SPSS 21.0 統計軟件對所得數據進行分析。計量資料以均數±標準差（）表示，采用重復測量方差分析，進一步兩兩比較，采用LSD-t 檢驗。計數資料以例數表示。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 厄貝沙坦不同給藥時間點對SHR 大鼠SBP 的影響

厄貝沙坦組與模型組大鼠SBP 在給藥后3 h 和24 h 中，時間及交互作用比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），而組間比較，差異有高度統計學意義（F=2023.083、864.881，P ＜0.01）。厄貝沙坦組SBP 首次給藥，第2、4、6、8 周給藥后3 h 及24 h 低于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。厄貝沙坦組SBP 在給藥后3 h 均有顯著下降，在給藥后24 h 有所回升，但仍低于治療前SBP。見表2。

表1 各基因引物序列

2.2 厄貝沙坦不同給藥時間點對SHR 大鼠DBP 的影響

厄貝沙坦組與模型組DBP 在給藥后3 h 和24 h時，時間及交互作用比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），而組間比較，差異有高度統計學意義（F=691.944、449.783，P ＜0.01）。厄貝沙坦組DBP 首次給藥后3 h低于模型組，第2、4、6、8 周給藥后3 h 及24 h 低于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表3。

2.3 厄貝沙坦對SHR 大鼠腎臟中各基因相對表達量的影響

與模型組比較，厄貝沙坦組ACE2 mRNA 相對表達量降低，AT2R mRNA 相對表達量升高，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表4。

表2 厄貝沙坦片不同給藥時間點對SHR 大鼠SBP 的影響（mmHg，）

表2 厄貝沙坦片不同給藥時間點對SHR 大鼠SBP 的影響（mmHg，）

注：與模型組同期比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。SBP：收縮壓。1 mmHg=0.133 kPa

表3 厄貝沙坦片不同給藥時間點對SHR 大鼠DBP 的影響（mmHg，）

表3 厄貝沙坦片不同給藥時間點對SHR 大鼠DBP 的影響（mmHg，）

注：與模型組同期比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。DBP：舒張壓。1 mmHg=0.133 kPa

表4 腎臟中ACE2、AT1R、AT2R mRNA 的相對表達量（）

表4 腎臟中ACE2、AT1R、AT2R mRNA 的相對表達量（）

注：與模型組同期比較，*P ＜0.05。ACE2：血管緊張素轉化酶2；AT1R：血管緊張素Ⅱ受體-1；AT2R：血管緊張素Ⅱ受體-2

3 討論

在降壓藥物研發過程中，谷峰比是其療效評價的一個重要指標。谷峰比越高提示在24 h 內藥物降壓作用越穩定，有助于減少對靶器官的損傷[8-9]。前期預實驗研究發現給藥3 h 的谷峰比最高，其降壓療效最穩定，故本研究選擇在給藥3 h 和24 h 這兩個時間段測量血壓，以評價厄貝沙坦的最大降壓療效。

高血壓對機體的心腦腎等器官具有嚴重損害，其發生、發展過程中涉及多個系統的參與。研究顯示[10]，腎素-血管緊張素系統（RAS）是參與血壓調節的重要系統。Ang Ⅱ是RAS 的主要活性物質，主要發揮收縮血管等作用[11]，主要作用于AT1R，小部分作用于AT2R[12]，其中AT1R 具有強烈的血管收縮作用，而AT2R介導的生物學作用與AT1R 相反，主要為利鈉作用，降低Na+在近曲小管中重吸收，保持Na+負平衡，進一步降低血壓[13]。厄貝沙坦通過拮抗AT1R 抑制Ang Ⅱ介導的血管收縮和醛固酮的釋放，從而產生降壓作用。AT1R 和AT2R 在血壓調節中存在功能性相互作用，AT1R 阻斷后Ang Ⅱ增加導致其對立的AT2R 的刺激升高作用，本研究結果中AT1R 表達降低，而AT2R升高，與文獻[14]報道結果一致。

近年來，ACE2 基因作為RAS 系統的新成員被廣泛研究，在體內的主要作用是將Ang Ⅱ轉化為Ang（1-7），后者在體內能引起血管擴張，產生降血壓的作用從而維持機體正常的血壓平衡[15-16]。ACE2 對最初高血壓形成起重要作用，多數文獻報道[17-22]沙坦類或其他藥物可使高血壓大鼠腎臟和心肌組織的ACE2 mRNA和蛋白表達增加，且多呈現出劑量依賴趨勢。而本研究卻發現厄貝沙坦治療后ACE2 表達降低，推測可能與文獻[23]所提出的通路有關，厄貝沙坦選擇性與AT1R結合，此時循環中Ang Ⅱ反饋增加，Ang Ⅱ又可以通過激活信號分子ERK1/2 和p38 MAP 上調ACE 并下調ACE2 的表達。厄貝沙坦使機體內血壓降到低點后，機體產生血壓調節的保護作用，不再需要ACE2 協同來發揮降血壓作用，從而厄貝沙坦組的ACE2 表達降低。由于本研究樣本量偏小，而且只設置了一個給藥濃度，后期可考慮多個給藥劑量，深入研究厄貝沙坦的劑量不同是否對ACE2 表達有所差異。盡管目前ACE2 的信號通路已經很好地建立，但Ang Ⅱ誘導的ACE2 的信號傳導機制仍然不太明確，后期需要進一步研究。