LncRNA C2-AS1通過DNA錯配修復相關通路抑制卵巢癌研究

雷 靜，黃 瑋

(寶雞市婦幼保健院，陜西 寶雞 721000)

卵巢癌是一類發病于卵巢內或卵巢上的惡性腫瘤，在女性生殖器官腫瘤中，發病率僅次于宮頸癌和子宮體癌[1]。由于其發病較為隱匿，缺乏典型癥狀，難以早期發現，導致相當一部分患者失去了早期治療的機會[2]，廣泛的盆腔和腹腔轉移極大地限制了治療手段，使得其成為了全球范圍內女性癌癥死亡的第4位常見原因[3]。有研究證實，lncRNA在DNA錯配修復(MMR)過程中也發揮了效用，同時，lncRNA也被報道與卵巢癌的進展有關[4]。本文通過檢測lncRNA C2-AS1表達水平，探究其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2015年1月至2017年12月在寶雞市婦幼保健院手術切除的卵巢癌標本，共23例。其中，19例患者年齡在60周歲以上，4例患者年齡不足60周歲，平均年齡(57.38±8.52)歲；pcTNM腫瘤分期：T1期1例，T2期10例，T3期12例；N0期2例，N1～3期21例；均為M0。所有23例標本均為配對的腫瘤及癌旁組織。本研究已通過醫院倫理委員會審批，患者已簽署知情同意書。

1.2 RNA測序

在手術后1h內獲取患者標本，在-80℃下轉運和保存，24h內將樣品送至上海市吉凱基因科技有限公司，由該公司進行RNA測序及結果輸出。

1.3 TCGA數據庫

TCGA數據庫是一個開放的公共數據庫，其內含400余例卵巢癌基因表達數據及預后數據，網址為https:∥cancergenome.nih.gov/。本研究使用其中數據后利用R 3.4.0和Prism7進行基因相關性分析及預后分析。

1.4 統計學方法

采用Prism 7、R 3.4.0進行數據分析和處理，使用R Studio搭載和運行R 3.4.0。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA C2-AS1是卵巢癌中低表達的lncRNA

通過對23對卵巢癌腫瘤及癌旁組織RNA-seq測序數據分析，鑒定出卵巢癌中差異表達的基因列表，共2 622個，其在染色體上的定位見圖1A。通過對這些基因進一步進行差異表達分析，選取signal to noise>0.3、P<0.001為界值鑒定出的腫瘤組織內差異表達的前50位基因，其中，lncRNA C2-AS1排名第四，在腫瘤組織中呈現低表達趨勢，是前50位差異表達基因中唯一一個lncRNA。左側綠色樣本為癌旁組織，右側紅色樣本為腫瘤組織，見圖1B。

2.2 LncRNA C2-AS1相關基因富集于DNA錯配修復通路

通過對2 622個基因進行WGCNA富集分析，可見納入分析的卵巢癌組織樣本無離群值，見圖2A。確定軟閾值后分步法構建模塊，最終構建一個含有12個模塊的差異基因加權共表達網絡模型，不同的模塊使用不同的顏色標識，其中，灰色模塊內是難以歸類的零散基因，見圖2B。LncRNA C2-AS1被富集于黃色模塊中，對模塊內基因進行KEGG通路富集分析，發現這些基因被富集于DNA錯配修復相關通路，見圖2C。

注：B圖左側綠色樣本為癌旁組織，右側紅色樣本為腫瘤組織。

圖1卵巢癌內高表達基因熱點圖

Fig.1 Gene heatmap in ovarian cancer

圖2 LncRNA C2-AS1功能預測

2.3 LncRNA C2-AS1與DNA錯配修復相關基因表達密切相關

選取了DNA錯配修復相關基因BRCA1、BRCA2、PD-L1(CD274)、MSH2、MSH6、MLH1、PMS2進行相關性分析，考慮到樣本量較小難以獲得可靠結果，使用TCGA數據庫數據，結果顯示，lncRNA C2-AS1與這些基因都有較好的相關性，見圖3。

圖3LncRNAC2-AS1與DNA錯配修復相關基因的表達正相關

Fig.3 LncRNA C2-AS1 was positive correlated with DNA mismatch genes

2.4 低表達lncRNA C2-AS1導致卵巢癌患者預后較差

上述結果證明了lncRNA C2-AS1在卵巢癌組織中呈低表達，并且同DNA錯配修復關系密切。選取TCGA數據庫進行了預后分析，結果顯示，低表達lncRNA C2-AS1導致了較差的卵巢癌預后，見圖4。

圖4 低表達lncRNA C2-AS1導致較差的卵巢癌預后

3 討論

3.1 LncRNA C2-AS1是卵巢癌中的抑癌lncRNA

卵巢癌嚴重威脅女性的生命健康，但是，其發生發展因素目前仍十分模糊，導致其難以得到早期診斷和治療。影響卵巢癌發病的風險因素包括激素水平、遺傳背景、環境因素和年齡等多種因素。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類不編碼蛋白質的長度超過200nt的RNA。既往大量研究顯示，許多非編碼RNA和腫瘤的發生發展關系密切，例如，lncRNA MALAT1通過PI3K-AKT通路促進卵巢癌細胞生長及轉移[5]，有研究報道，miRNA-124同卵巢癌進展和轉移關系密切[6-7]。同時，某些lncRNA同DNA錯配修復有關，例如，lncRNA-XIST通過DNA錯配修復相關通路調節膠質瘤化療抵抗功能。

本研究利用對23對卵巢癌及癌旁組織的測序結果進行分析發現，lncRNA C2-AS1在卵巢癌中呈明顯低表達，同時選用TCGA公共數據庫對該lncRNA表達情況不同的患者進行了預后分析，結果顯示低表達lncRNA C2-AS1患者預后明顯較差，結果支持了該lncRNA可能是卵巢癌中的一種抑制腫瘤進展的lncRNA。但是，關于該lncRNA通過何種方式抑制卵巢癌進展尚無相關報道，因此，我們更進一步地進行了研究，利用WGCNA方法探索了lncRNA C2-AS1可能參與的通路，得到了一些有趣的結果。

3.2 LncRNA C2-AS1可能通過DNA錯配修復相關通路調控卵巢癌進展

近年研究發現，DNA錯配修復相關基因BRCA1和BRCA2突變的卵巢癌患者預后明顯較未突變患者差，提示患者的遺傳背景差異對于卵巢癌的預后和治療靶點的尋找可能具有重要意義[8-9]。同時，有研究報道，DNA錯配修復(MMR)是基因層面導致卵巢癌預后較差的重要因素，同時，MMR和多種腫瘤的發生發展有關[10-11]。但是，MMR是一個復雜的過程，仍未清楚其機制，目前有一些研究報道了其中的幾種關鍵基因，包括BRCA1、BRCA2、PD-L1(CD274)、MSH2、MSH6、MLH1、PMS2等[12-16]。包含但不限于這些基因的共同作用，保證了MMR的正常運行，抑制腫瘤的發生發展。

本研究對23對腫瘤及癌旁組織測序數據進行WGCNA后，我們發現，lncRNA C2-AS1共表達基因被顯著富集于DNA錯配相關通路上，以上提到的關鍵基因基本都囊括在內。為了研究lncRNA C2-AS1與這些基因的關系，我們選用了樣本量較大的TCGA數據庫對它們做了相關性分析，結果顯示，該lncRNA同這些基因都呈現顯著的正相關關系，更進一步地提示了lncRNA C2-AS1可能通過影響這些基因的表達或功能從而參與DNA錯配修復的過程，影響卵巢癌的進展。但是，尚未對該lncRNA及這些基因進行功能學及分子生物學實驗驗證，后期需要跟進更多的工作完善及證實相關理論。

綜上所述，本研究通過利用高通量二代測序技術檢測患者腫瘤及癌旁組織內的基因表達情況，篩選卵巢癌中差異表達的lncRNA，預測其功能，尋找在MMR過程中發揮作用的lncRNA并驗證其與MMR相關基因表達的相關性。本研究首次提出了lncRNA C2-AS1低表達導致卵巢癌預后較差，同時lncRNA C2-AS1與MMR通路及其相關基因表達密切關聯。本研究為探討卵巢癌的發病機制提供了新的理論研究結果，為建立卵巢癌的臨床治療和評估預后靶點提供了新的思路。