周圍神經趨化性再生研究新進展*

賀倩茹 丁 斐

（江蘇省神經再生重點實驗室，南通 226001）

周圍神經損傷的修復及功能重建一直是臨床治療的難題。神經損傷后修復及功能恢復，主要取決于斷端的橋接修復，再生神經的生長速度及其對靶器官精確再支配，涉及到特異性趨化作用、橋梁作用和微環境作用[1]。雖然近年來隨著顯微外科和組織工程學的發展，在神經橋接吻合及促進神經再生方面取得了一定進展，但神經功能恢復仍不理想[2]。主要原因歸結于感覺和運動神經再生軸突的錯向生長，即感覺神經軸突錯向長入運動神經內膜管，運動神經軸突錯向長入感覺神經內膜管，均會導致再生神經功能恢復不佳。

周圍神經主要由神經元的軸突和包繞軸突的施萬細胞（Schwann cells）組成，成纖維細胞是神經內膜、神經束膜和神經外膜的主要成分，此外還存在少量血管內皮細胞、巨噬細胞以及中性粒細胞。周圍神經損傷后的再生，需要神經元與再生微環境中的施萬細胞、成纖維細胞（fibroblasts）、巨噬細胞、血管內皮細胞以及細胞外基質之間復雜而精確的相互作用，引導再生軸突沿著特定的通路延伸到達遠側端，再支配靶器官[3，4]。因此，充分理解周圍神經再生的細胞和分子生物學基礎，并在臨床治療中加以運用，對促進周圍神經功能更好恢復具有非常重要的意義。

1 周圍神經趨化性再生理論概述

周圍神經趨化性再生理論認為，在神經發育與再生的過程中，新生軸突受到遠側斷端神經或靶組織釋放的化學物質誘導作用而定向生長。神經趨化性（neurotropism）的概念最早由Forssman 于1898年提出。其研究發現離斷神經近側斷端總是向遠側斷端生長，而不向其他組織生長，據此假設再生的軸突由于受遠端神經可彌散物質的濃度梯度引導，向著產生此類物質的遠側端神經生長。Cajal（1928年）研究發現神經橫斷后，即使人為破壞近、遠側斷端良好的對合關系，兩斷端間留有小的間隙，近側端仍舊會向遠側端生長。這種定向作用是由于遠端神經分泌的特殊物質，并形成濃度梯度而產生的，進一步證實了周圍神經趨化性生長現象的存在。

顧曉松等[5]將背根神經節（dorsal root ganglion，DRG）與正常神經組織和離斷后的神經遠側端進行聯合培養，結果顯示DRG 發出的軸突選擇性地向遠側端延伸，而不向其他方向生長。生長過程中神經元呈集聚狀態，并在施萬細胞引導下向遠側端定向遷移，從細胞水平為神經趨化性生長理論提供了佐證。Brushart 等[6-7]的一系列研究表明大鼠股神經橫斷后，即使錯向對接、保留距離對接或去除末端靶器官，運動神經元軸突最終總是優先進入再支配肌肉的分支，因此提出選擇性運動神經再生（preferential motor reinnervation，PMR）概念，為趨化性再生理論提供了更有力的佐證。PMR 現象的產生是由于運動軸突再生進入運動神經內膜管可以存活，而進入感覺神經內膜管的運動軸突會被 “修剪”（pruning）。研究者用大鼠股神經近端連接 Y 形管近端，遠端分別與股四頭肌肌支和隱神經連接，結果顯示股神經橫斷2 周時，運動神經元軸突再生進入運動和感覺神經內膜管的數量相近；在3 周時，再生進入運動神經內膜管的運動軸突數量顯著增加，而進入感覺神經內膜管的運動軸突數量減少，至損傷后8 周差異更加顯著。H?ke等[8]研究顯示感覺神經軸突再生過程中也優先進入感覺神經內膜管。

2 周圍神經趨化性再生的細胞與分子生物學機制

2.1 神經元與遠側端神經

周圍神經損傷后，近側端軸突回縮，軸膜生長并封閉斷端，軸突腫脹膨大形成回縮球。遠側端神經發生瓦勒變性，軸突和髓鞘變性崩解，被增殖的施萬細胞與巨噬細胞清除。同時施萬細胞在基底膜管內形成細胞索（Büngner 帶），并分泌多種因子，為軸突再生營造適宜的微環境。再生軸突在基底膜管和 Büngner 帶的支撐以及神經營養因子（NTFs）的刺激下，生長錐按正確的方向向遠端靶組織延伸，最終實現神經再支配。

感覺和運動神經元在解剖結構、對損傷的反應以及生長需求等方面均有不同。胚胎發育期神經管發育為大腦和脊髓，包括運動神經元，而神經板邊緣形成神經嵴，最終形成包括DRG 感覺神經元在內的周圍神經。感覺神經元軸突切斷后，肌動蛋白、生長相關微管蛋白、生長相關蛋白-43 和cAMP[9]等多種再生相關基因上調，轉錄因子如激活轉錄因子-3（ATF-3）、c-Jun、Sox11 和信號轉導與轉錄激活子3表達增加[10-11]；而神經絲蛋白、參與神經遞質合成的離子通道和蛋白質表達減少[12]。感覺神經損傷后大量mRNA 通過特定機制進入感覺軸突，在再生神經軸突到達遠端前，這些mRNA 翻譯受到保護[13]。ATF-3 作為應激標記物，損傷后在運動神經元中持續高表達，導致運動神經再生障礙，但僅在易于再生的感覺神經元中短暫高表達[14]。此外，Rho/ROCK 通路因調節肌動蛋白細胞骨架而促進軸突的生長和發育一直備受關注。在生長抑制劑如硫酸軟骨素蛋白多糖（CSPGs）存在下，Rho 相關激酶的失活和ROCK 的抑制可以促進軸突生長[15]。然而，由于RhoA 的不同激活水平，Rho/ROCK 通路的抑制對運動和感覺軸突再生產生不同影響。CSPGs 存在時，運動神經元比感覺神經元對ROCK 的抑制反應更靈敏，軸突延伸更長[16]。整合素（integrin）可促進感覺神經元軸突再生，CSPGs 存在時，整合素與其激活劑kindlin-1 可顯著促進長距離（25 mm）缺損感覺軸突再生[17]。然而，隨著運動神經元的成熟，軸突運輸主要為逆向運輸，且軸突起始段負責排除整合素，導致整合素被選擇性地排除在軸突之外，僅在胞體和樹突區域表達[18-19]。表明感覺和運動神經元之間的關鍵區別在于感覺神經元中較多促進生長的分子進入軸突，而在運動神經元中被排除在軸突外。

NTFs 在神經元的生長、發育和分化等過程中均發揮重要作用，可以促進損傷后軸突的再生[20]。在NTFs 包埋的膠原基質中，感覺神經元比運動神經元表現出更強的生長能力[21]。研究表明神經生長因子（NGF）可以顯著促進感覺神經元突起生長，腦源性神經營養因子（BDNF）對運動神經元有明顯促進作用，而膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）可以促進2 種神經元的再生。造成此差異的主要原因是NGF 受體TrkA 僅在感覺神經元中表達，而BDNF 受體Trk B 在運動神經元中有較高表達[22]。目前關于感覺與運動神經元內在差異的研究仍然有限，未來隨著單細胞測序等技術的發展，將會有更多研究聚焦于2 種神經元內在特征的不同。

周圍神經損傷后，如果遠端基底膜管得以保留，施萬細胞和成纖維細胞增殖，巨噬細胞浸潤，釋放各種NTFs，對再生軸突起著支持和引導作用。因此，神經遠側端在趨化性再生中起至關重要作用。

Takahashi等[23]建立大鼠隱神經Y形管再生模型，遠端分別置入體積不同的神經組織，比較6 周后遠側端再生軸突數目，顯示遠端神經體積大的一側再生軸突數量多。大鼠脛-腓神經Y形管再生模型[24]和尺神經-正中神經Y形管再生模型[25]研究均顯示，遠端神經體積顯著影響神經趨化性再生的軸突數目，若遠端神經粗大，則再生軸突數量多，并且兩側再生軸突數目之比與正常神經軸突數目之比呈正相關。股神經再生模型發現運動神經元正確再生軸突數量取決于遠側端神經所產生的營養支持，再生軸突優先長入營養支持多的一側，并認為營養支持可能由遠端施萬細胞和終末器官及其相互作用產生[26]。Robinson等[27]在股神經Y形管模型中顯示，當遠端接入大小相似的感覺與運動神經時，再生的運動軸突最初均等向兩側生長，但最終趨向于運動神經端；而當遠端接入的感覺神經較粗大時，再生的運動軸突則趨向于感覺神經端生長。因此認為，運動軸突再生受遠端神經體積大小的影響，該影響的基礎為遠端神經施萬細胞分泌相關的NTFs，以誘導近端神經再生。Moradzadeh等[28]提出神經體系構架（nerve architecture）理論，認為施萬細胞基底膜管的尺寸在神經趨化性再生中起著重要作用。與感覺神經相比，運動神經具有更大的施萬細胞基底膜管，損傷后可以允許更多的再生軸突長入，從而得到更好修復。因此，運動神經的移植修復效果通常要優于感覺神經。本課題組建立大鼠單純感覺與運動神經損傷模型，結果顯示神經橫斷14 d，與軸突再生與導向相關蛋白如睫狀神經營養因子、載脂蛋白D和整合素連接激酶等在感覺與運動神經遠側端差異表達，而這些差異表達蛋白究竟為遠側端何種細胞表達還有待進一步研究[29]。

2.2 施萬細胞

施萬細胞在周圍神經再生過程中發揮重要的趨化作用和微環境作用。施萬細胞來源于神經嵴，在胚胎發育期由前體施萬細胞沿軸突移行，并逐步發育，分化為成髓鞘施萬細胞和非成髓鞘施萬細胞[30]。神經損傷后其迅速去分化，并增殖、合成和分泌多種NTFs、細胞黏附分子以及細胞外基質，在清除軸突碎片、維持神經元胞體存活、促進軸突再生以及引導軸突再生方向等過程中發揮重要作用[31-32]。

早期的研究表明 L2/ HNK-1 蛋白主要由運動神經來源的施萬細胞分泌，在運動神經施萬細胞中高表達，而感覺神經中的施萬細胞表達很少。并且 L2/ HNK-1 蛋白只影響運動神經神經元生長，而不影響感覺神經元[33]。神經細胞黏附分子也被發現只在感覺神經的非成髓鞘施萬細胞中表達[34]。H?ke 等[8]研究顯示周圍神經損傷再生過程中，感覺與運動神經施萬細胞NTFs 具有不同的表達模式：NGF、血管內皮細胞生長因子、BDNF、胰島素樣生長因子-1 和肝細胞生長因子在感覺神經施萬細胞中明顯高表達，而多效蛋白和GDNF 在運動神經施萬細胞中明顯高表達。據此認為周圍神經趨化性再生具有表型特異性，施萬細胞可分為感覺與運動表型，其分泌的神經營養因子不全相同，故對感覺和運動神經元軸突的定向生長起不同的調節作用，從而支持相同表型的神經軸突再生。此外，運動終板末梢的施萬細胞在慢性失神經肌肉神經重建過程中發揮重要作用。錯過窗口期，到達靶器官的運動軸突無法重新支配運動終板。而無論再生早期或晚期，感覺軸突能以相似的程度重新再支配皮膚。筆者認為運動終板上的施萬細胞在長時間去神經支配后可能變得不允許再生，并阻止運動軸突與肌肉的功能性突觸形成[35]。2012年本課題組采用定量蛋白質組學技術首次建立了大鼠感覺與運動神經的全蛋白質組表達譜，并獲得差異表達蛋白，56個感覺神經高表達蛋白主要為細胞黏附蛋白、鈣結合蛋白和脂代謝蛋白等；而44個為運動神經高表達蛋白主要為細胞骨架蛋白、細胞外基質分子和NTFs等。通過免疫組織化學顯色對差異表達蛋白進行定位，顯示差異表達蛋白既有神經元表達的差異，也有施萬細胞表達差異，如神經細胞黏附分子 1（NCAM1）和L1 樣細胞黏附分子（L1）均在感覺神經施萬細胞中高表達[36]。同時顯示感覺和運動神經施萬細胞具有不同的生物學特性，體外培養的感覺和運動神經施萬細胞其增殖和遷移能力均不同，并且相關基因的表達也不同[37]。Jesuraj 等[38]通過基因芯片技術分析大鼠感覺與運動神經施萬細胞的基因表達存在顯著差異，從基因水平進一步證明周圍神經施萬細胞存在感覺與運動表型。本課題組利用蛋白質組學技術檢測了原代培養的小鼠感覺與運動神經施萬細胞，結果顯示2 種類型施萬細胞蛋白表達存在顯著差異，分別有63 和11個蛋白在感覺和運動神經施萬細胞中高表達，并且差異表達蛋白影響施萬細胞增殖能力[39]。Wright 等[40]研究顯示神經再生過程中，感覺神經施萬細胞分泌的骨橋蛋白和運動神經施萬細胞分泌的叢生蛋白分別支持感覺和運動神經元軸突的再生。這2 種表型的施萬細胞在維持感覺與運動神經正常功能以及趨化性再生過程中發揮重要作用，在施萬細胞中過表達某些NTFs 或膜黏附分子等，可能有助于闡明感覺與運動神經施萬細胞的差異，并促進選擇性軸突再生。

2.3 成纖維細胞及其他細胞

周圍神經系統中，成纖維細胞是組成神經內膜、神經外膜和神經束膜的主要細胞成分[41]。傳統的觀點認為成纖維細胞產生疤痕是不利于神經再生恢復[42]。然而，近年越來越多的研究表明成纖維細胞在周圍神經再生過程中發揮重要的作用。Lewis等[43]在斑馬魚模型中發現一類神經膠質細胞在神經損傷后先于施萬細胞清除碎片，并形成再生橋，引導運動軸突再生，并推測此神經膠質細胞為成纖維細胞。Parrinello 等[3]研究顯示周圍神經損傷后，首先出現大量的成纖維細胞聚集在損傷部位的最前端，并在再生過程中引導施萬細胞和再生軸突排列的方向，而此引導效應主要是由受體型酪氨酸激酶配體Ephrin-B/EphB2信號通路介導。使用神經外膜成纖維細胞條件培養基培養神經元和施萬細胞，條件培養基中的可溶性蛋白可以促進感覺神經元突起生長和施萬細胞遷移[44]。顧曉松團隊的研究也發現周圍神經損傷后，損傷近側端的成纖維細胞大量分泌細胞外基質組分腱糖蛋白C（TNC），與施萬細胞膜表達的整合素-β1（integrin-β1）受體作用后激活胞內信號，進而引導施萬細胞遷移[45]。角膜間質成纖維細胞條件培養基中包含多種生物活性因子，并以濃度梯度依賴的方式促進DRG 神經元突起的生長[46]。以上研究肯定了成纖維細胞分泌的生物活性物質在促進施萬細胞遷移和神經元生長方面發揮重要作用。

本課題組通過基因芯片技術分析大鼠感覺與運動神經成纖維細胞的基因表達，發現其基因表達存在差異。感覺神經成纖維細胞高表達基因主要涉及細胞增殖、遷移、趨化和免疫反應等生物學過程，而運動神經成纖維細胞高表達基因主要涉及神經元分化和模式特異性等生物學過程。感覺神經成纖維細胞增殖和遷移速率均高于運動神經成纖維細胞，趨化因子CXCL3 和CXCL10 在感覺與運動神經成纖維細胞增殖和遷移過程中發揮不同的作用。感覺和運動神經成纖維細胞和施萬細胞共培養實驗顯示，成纖維細胞可以促進相同表型施萬細胞向自身方向遷移[47]。據此筆者認為神經成纖維細胞具有不同的感覺與運動表型，涉及不同的基因表達模式、生物學過程，并對不同表型施萬細胞產生不同的生物學作用。

此外，巨噬細胞、內皮細胞以及中性粒細胞也在神經再生過程中發揮著重要作用。神經橫斷2 d 再生神經橋中細胞比例為：巨噬細胞50%、中性粒細胞24%、成纖維細胞13%、血管內皮細胞5%。巨噬細胞最先感受缺氧狀態，并分泌血管內皮細胞生長因子；吸引內皮細胞遷移至損傷部位，并縱向排列形成血管；引導施萬細胞遷移，并介導軸突再生[48]。而血管內皮細胞和中性粒細胞在趨化性再生的作用目前未見報道。

2.4 軸突導向因子

神經系統發育與再生過程中，軸突的生長方向受吸引性和排斥性導向因子作用，引發一系列胞內信號轉導機制，從而引導軸突到達正確的靶器官[1]。目前發現的軸突導向因子家族主要包括四大類：導素（Netrins）、Eph 相關受體酪氨酸激酶配體（Ephrins）、Slit 和信號素（Semaphorins）[49]。

導素是一類與層黏連蛋白相關的胞外蛋白家族，在神經系統發育過程中對軸突引導起關鍵作用。目前鑒定的4 種分泌型導素1、3、4 和5 中，導素1 是家族中最具特征的成員。導素1 能與DCC、新生素（Neogenin）和CD146 等多種受體結合，介導吸引或排斥作用，但對軸突的吸引作用主要由DCC 受體介導[50]。周圍神經損傷后施萬細胞中導素1表達上調，促進軸突再生和功能恢復。斑馬魚模型去除運動神經元的DCC 可導致神經橋中再生的運動軸突偏離其原始路徑進入異位軌道[51-52]。以上研究表明施萬細胞分泌的導素1 通過與軸突上的DCC 受體作用引導神經橋的軸突再生。

Ephrins受體包括Eph-A和Eph-B兩大類。Ephrin/Eph信號在胚胎神經系統發育和損傷后神經再生過程中均發揮重要作用[53]。神經損傷后，成纖維細胞表達Ephrin-B 與施萬細胞上的EphB2 受體作用激活下游信號，在再生橋中引導施萬細胞遷移、排列和軸突再生的方向[3]。

Slit家族包括Slit1/2/3，和其受體Robo（Robo1/2）結合主要介導軸突的排斥作用[54]。Slits蛋白既可促進感覺神經元軸突分支，也可排斥運動神經元突起生長，還能使嗅神經元投射的軸突改變方向[55]。周圍神經損傷后神經橋最外層的巨噬細胞分泌Slit3，與橋內施萬細胞和成纖維細胞表面的Robo1 作用介導排斥效應，引導施萬細胞和成纖維細胞沿著正確的軌跡前行，并引導軸突再生[4]。

Semaphorins（SEMA）家族成員與其受體復合物（NP-1、PlexinA 和L1）結合，在軸突生長過程中主要介導排斥作用[56-57]。而當SEMA 3A 激活cAMP 和cGMP 途徑時，其功能則由排斥轉變為吸引[58]。SEMA 3A 作用于受體復合物導致神經元生長錐萎縮塌陷主要通過激活FAK-MAPK信號通路來介導[59]，并且瞬時表達軸索糖蛋白1，對于調節結合后的胞吞轉運起著關鍵作用[60]。股神經橫斷模型發現運動神經遠側端高表達SEMA3A 可能通過與感覺神經近側端高表達的L1 相互作用，排斥再生的感覺軸突進入錯誤運動神經通路，轉而進入正確的感覺神經通路[61]。

3 展望

周圍神經損傷后良好的修復需要再生微環境中各種細胞和因子復雜而精細的調控，施萬細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、血管內皮細胞和中性粒細胞等細胞以及各種NTFs、細胞生長因子和軸突導向因子等共同構成了神經再生微環境[62]。研究再生微環境中關鍵的細胞和分子如何參與控制神經橋中細胞協調的機制，將有助于將來開發更好的工程化神經組織，促進神經功能良好的恢復。