定向誘導為神經元樣細胞的骨髓間充質干細胞對大鼠坐骨神經損傷的修復作用研究

胡安全 馮祁軍 王正安 秦 力 李 哲

浙江省嘉興市第一醫院骨科，浙江嘉興 314000

周圍神經損傷多見于高能量暴力損傷患者[1]，尤其以坐骨神經損傷最難處理且術后恢復緩慢，這與周圍神經的再生和修復能力有限、功能恢復差有關。目前骨髓間充質干細胞（BM-MSCs）已經成為組織工程、細胞治療領域理想的種子細胞[2-3]，尤其可用于周圍神經損傷的再生細胞治療[4]。但是由于干細胞移植在體內的存活率和分化率不理想，患者很難獲得理想的臨床效益[5-7]。為了提高BM-MSCs 移植對坐骨神經損傷的再生與修復作用，本研究在體外通過不同的誘導方法定向誘導BM-MSCs 向神經元樣細胞分化，并進一步通過大鼠坐骨神經損傷模型，以證實在體外定向誘導為神經元樣BM-MSCs 有促進大鼠神經損傷恢復和神經遞質分泌的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

12 只SPF 級4 周齡雄性SD 大鼠（175±10）g 和90 只SPF 級3 月齡雄性SD 大鼠（225±25）g 購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號：SCXK（浙）2019-0001]，動物房溫度（22±1）℃，濕度（50±5）%，適應性喂養1 周后進行實驗，實驗過程中遵循“3R”原則。

BriCyte E6 型流式細胞儀購自深圳邁瑞醫療公司；β-巰基乙醇（貨號：0482-250ML）和全反式視黃酸（貨號：C20734-100mg）購自美國Sigma 公司；免疫印跡一抗腦源性神經營養因子（BDNF）（貨號：ab108319）、髓磷脂堿性蛋白（MBP）（貨號：ab20216）和生長關聯蛋白43（GAP-43）（貨號：ab75810）購自英國Abcam 公司。

1.2 BM-MSCs 分離培養及鑒定

取12 只4 周齡大鼠，窒息處死。參照Maridas 等[8]、Huang 等[9]方法取大鼠雙側股骨及脛骨分離骨髓細胞。細胞培養用常規細胞貼壁篩選法，通過多次1∶1傳代在體外進行純化。取1.0×106個/mL P3 代細胞加入適量鼠抗人抗體CD29、CD44、CD90 免疫熒光鑒定，流式細胞儀檢測BM-MSCs 表面標志物。

1.3 BM-MSCs 定向誘導和分化

將BM-MSCs 細胞分為化學誘導分化組（β-巰基乙醇組和全反式視黃酸組）、Transwell 小室共培養組和對照組（不作處理）。化學誘導分化組按1.0×105個/mL濃度接種于蓋玻片上，用低糖DMEM 培養基培養，達到70%融合時，換成含3 mmol/L β-巰基乙醇或1 μmol/L 全反式視黃酸的培養基誘導。Transwell 小室共培養組，取細胞懸液，培養貼壁細胞至有神經網狀結構后，按1×106個/mL 的密度接種于Transwell 雙層培養皿的底層，Transwell 內板中接種骨髓間充質干細胞。

誘導7 d 后，免疫組化法檢測神經元特異性烯醇化酶表達。并用細胞免疫熒光染色法和流式細胞術法鑒定神經分化標志物膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、神經營養素（NT3）、微管相關蛋白2（MAP2）、Tau、趨化因子基質細胞衍生因子-1 受體（CXCR4）、神經微絲蛋白200 kD（N200）、NESTIN、泛素（UBIQUITIN）、微管蛋白Ⅲ（TUBULIN Ⅲ）陽性表達情況。

1.4 大鼠坐骨神經缺損模型的建立和分組

取90 只3 月齡SD 大鼠，按照隨機數字表法分為假手術組、模型組、普通細胞組與定向誘導組。除假手術組20 只外，其余70 只大鼠用鉗夾法建立大鼠坐骨神經損傷模型[10]。操作方法：腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定。常規備皮、消毒后，鈍性分離左大腿肌肉。顯露坐骨神經，在大腿根部用動脈瘤夾鉗夾坐骨神經，鉗夾10 s，反復3 次，造成3 mm 的損傷區。手術過程中，顯微鏡觀察到其外膜連續而神經軸突中斷。含抗生素鹽水清潔傷口后，縫合組織。術后，以大鼠左下肢反應遲鈍，屈伸力量明顯減弱，為造模成功的標準。假手術組大鼠僅暴露坐骨神經，而不用夾鉗損傷神經，隨后縫合組織。最終造模成功63 只，為了平衡每組動物數量，隨機剔除3 只大鼠，確保每組20 只大鼠。術后用微量注射器將10 μL 的P3 代BM-MSCs 懸液（1×106個）和經定向誘導分化的神經元樣細胞懸液（1×106個）分別植入普通細胞組和定向誘導組大鼠坐骨神經損傷處。假手術組和模型組注入等量生理鹽水。注射3 min，留針5 min。注射完成后，繼續飼養12 周。

1.5 坐骨神經功能指數（SFI）評估

自制大鼠足跡行走箱，采集四組2、4、8、12 周（細胞移植后）大鼠足印，根據Bain 公式[11]計算并比較各組大鼠的SFI。SFI 測定結果介于-100（完全失去神經支配功能）～0（運動正常）。

1.6 大鼠運動功能評估

采用Basso Beattie Bresnahan（BBB）運動功能評分法評估大鼠運動功能，自大鼠造模后2、4、8、12 周（細胞移植后）對大鼠模型進行盲法評分。BBB 分值介于0（完全失去神經支配功能）～21 分（運動正常）[12]。

1.7 肌濕重恢復率比較

實驗結束后，取大鼠實驗側（E）和健側（N）小腿三頭肌稱重，根據公式[13]（肌濕重恢復率=E 肌濕重/N肌濕重×100%）計算肌濕重恢復率。

1.8 大鼠坐骨神經中BDNF、MBP 和GAP-43 蛋白表達水平檢測

BBB 運動功能評分后，通入過量二氧化碳，將大鼠安樂死。收集大鼠坐骨神經組織，提取總蛋白。經BCA 法測定蛋白濃度后，加入適量樣品緩沖液調節蛋白濃度為0.5 μg/μL，100℃水浴5 min 后，SDS-PAGE膠上每孔上樣20 μL。120 V 40 min 后轉膜7 min。至5%的脫脂奶粉中封閉30 min。加入相應的一抗（1:1000）稀釋液，4℃儲存，過夜；加HRP 標記二抗（1:1000），水平搖床，室溫封閉1 h 后，TBST 洗3 次，每次10 min，顯影。

1.9 統計學方法

采用GraphPad Prism 6 統計學軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（）表示，不同時間點比較采用重復測量方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BM-MSCs 形態變化及鑒定

大鼠BM-MSCs 培養24 h 后，只有少數細胞貼壁生長；貼壁細胞在常規培養72 h 后開始增殖，逐漸出現出現長短不一的突起，并呈集落樣生長。P3 代細胞生長態勢均一，排列緊密，呈渦旋狀集落，見圖1。經流式細胞術鑒定，P3 代BM-MSCs 可高表達CD29、CD44、CD90，幾乎不表達CD45，見圖2。

圖1 倒置顯微鏡下觀察BM-MSCs 細胞形態（100×）

2.2 不同誘導方法對BM-MSCs 神經元特異性烯醇化酶陽性表達率的影響

整體比較：不同誘導方法對BM-MSCs 神經元特異性烯醇化酶陽性表達率組間、時間及交互作用比較，差異均有統計學意義（均P<0.05）。組內比較：對照組各時間點BM-MSCs 神經元特異性烯醇化酶陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。β-巰基乙醇組、全反式視黃酸組、Transwell 小室共培養組各時間點比較，差異均有統計學意義（均P<0.05）。組間比較：第1 天，Transwell 小室共培養組BM-MSCs神經元特異性烯醇化酶陽性表達率高于β-巰基乙醇組、全反式視黃酸組；全反式視黃酸組BM-MSCs 神經元特異性烯醇化酶陽性表達率低于β-巰基乙醇組；β-巰基乙醇組BM-MSCs 神經元特異性烯醇化酶陽性表達率高于對照組。第3、5、7 天，四組各時間點組間兩兩比較，差異均有統計學意義（均P<0.05）。見表1。

圖2 流式細胞術檢測P3 代BM-MSCs 細胞表面抗原

誘導7 d 后，β-巰基乙醇組BM-MSCs 神經元特異性烯醇化酶陽性表達率高于其他三組，故而選擇β-巰基乙醇組定向誘導分化7 d 后的BM-MSCs 用于后續動物實驗。

表1 不同誘導方法對BM-MSCs 神經元特異性烯醇化酶陽性表達率的影響（%，，n=3）

表1 不同誘導方法對BM-MSCs 神經元特異性烯醇化酶陽性表達率的影響（%，，n=3）

注：與同組第1 天比較，*P <0.05；與同組第3 天比較，#P <0.05；與同組第5 天比較，&P <0.05；與對照組同期比較，aP <0.05；與β-巰基乙醇組同期比較，bP <0.05；與全反式視黃酸組同期比較，cP <0.05。BM-MSCs：骨髓間充質干細胞

2.3 β-巰基乙醇定向誘導分化7 d 后的BM-MSCs神經分化標志物檢測

免疫熒光染色法顯示，神經分化標志物CXCR4、GFAP、NT3、MAP2、Tau、N200 表達率為75%～100%，NESTIN 陽性表達率為50%～75%，而UBIQUITIN、TUBULIN Ⅲ檢出率為25%～50%，見圖3。經流式細胞術法顯示，GFAP、NT3、MAP2、Tau、N200陽性表達率超過70%，CXCR4、NESTIN、UBIQUITIN、TUBULIN Ⅲ細胞陽性表達率低于70%，見圖4。

圖3 免疫熒光染色法檢測β-巰基乙醇定向誘導分化7 d 后BM-MSCs 神經分化標志物（10 000×）

2.4 四組術后2、4、8、12 周SFI 比較

圖4 流式細胞術檢測β-巰基乙醇定向誘導分化7 d 后BM-MSCs 神經分化標志物

整體比較：各組大鼠SFI 組間、時間及交互作用比較，差異均有統計學意義（均P<0.05）。組內比較：假手術組各時間點SFI 比較，差異無統計學意義（P>0.05）；模型組、普通細胞組、定向誘導組各時間點SFI比較，差異均有統計學意義（均P<0.05）。組間比較：模型組術后2、4、8、12 周SFI 低于假手術組，差異均有統計學意義（均P<0.05）。定向誘導組術后2、4、8、12 周SFI 高于模型組、普通細胞組；普通細胞組術后2、4、8、12 周SFI 高于模型組，差異均有統計學意義（均P<0.05）。見表2～3。

表2 假手術組和模型組術后2、4、8、12 周SFI 比較（%，，n=20）

表2 假手術組和模型組術后2、4、8、12 周SFI 比較（%，，n=20）

注：與同組2 周比較，*P <0.05；與同組4 周，#P <0.05；與同組8 周，&P <0.05；與假手術組同期比較，aP <0.05。SFI：坐骨神經功能指數

表3 模型組、普通細胞組、定向誘導組大鼠在術后2、4、8、12 周SFI 結果（%，，n=20）

表3 模型組、普通細胞組、定向誘導組大鼠在術后2、4、8、12 周SFI 結果（%，，n=20）

注：與同組2 周比較，*P <0.05；與同組4 周，#P <0.05；與同組8 周，&P <0.05；與模型組同期比較，bP <0.05；與普通細胞組同期比較，cP <0.05。SFI：坐骨神經功能指數

2.5 四組術后2、4、8、12 周BBB 評分比較

整體比較：各組大鼠BBB 評分組間、時間及交互作用比較，差異均有統計學意義（均P<0.05）。組內比較：四組術后8 周、12 周BBB 評分高于術后2 周和4 周，差異均有統計學意義（均P<0.05）；四組術后2 周和4 周BBB 評分比較，差異無統計學意義（P>0.05）。組間比較：模型組術后2、4、8、12 周BBB 評分低于假手術組，差異均有統計學意義（均P<0.05）。定向誘導組術后8、12 周BBB 評分高于模型組和普通細胞組；普通細胞組術后8、12 周BBB 評分高于模型組，差異均有統計學意義（均P<0.05）。見表4～5。

2.6 四組肌濕重恢復率比較

實驗結束后，模型組大鼠肌濕重恢復率為（42.50±2.17）%，低于假手術組的（92.58±4.57）%，差異有統計學意義（P<0.05）。定向誘導組肌濕重恢復率為（65.78±3.36）%，高于普通細胞組的（52.45±3.34）%及模型組；普通細胞組肌濕重恢復率高于模型組，差異均有統計學意義（均P<0.05）。

表4 假手術組和模型大鼠術后2、4、8、12 周BBB 評分結果（分，，n=20）

表4 假手術組和模型大鼠術后2、4、8、12 周BBB 評分結果（分，，n=20）

注：與同組2 周比較，*P <0.05；與同組4 周，#P <0.05；與同組8 周，&P<0.05；與假手術組同期比較，aP<0.05。BBB：Bsso Beattie Bresnahan

表5 模型組、普通細胞組、定向誘導組大鼠術后BBB 評分結果（分，，n=20）

表5 模型組、普通細胞組、定向誘導組大鼠術后BBB 評分結果（分，，n=20）

注：與同組2 周比較，*P <0.05；與同組4 周，#P <0.05；與同組8 周，&P <0.05；與模型組同期比較，bP <0.05；與普通細胞組同期比較，cP <0.05。BBB：Bsso Beattie Bresnahan

2.7 四組BDNF、MBP 和GAP-43 蛋白表達比較

模型組BDNF、MBP 與和GAP-43 蛋白表達量低于假手術組，差異均有統計學意義（均P<0.05）。定向誘導組BDNF、MBP 和GAP-43 蛋白表達量高于模型組和普通細胞組；普通細胞組BDNF、MBP 和GAP-43 蛋白表達量高于模型組，差異均有統計學意義（均P<0.05）。見圖5、表6。

圖5 Western blot 法檢測各組BDNF、MBP和GAP-43 蛋白表達差異

表6 Western blot 法檢測各組BDNF、MBP和GAP-43 蛋白表達量（，n=20）

表6 Western blot 法檢測各組BDNF、MBP和GAP-43 蛋白表達量（，n=20）

注：與假手術組，aP <0.05；與模型組，bP <0.05；與普通細胞組，cP <0.05。BDNF：腦源性神經營養因子；MBP：髓磷脂堿性蛋白；GAP-43：生長關聯蛋白43

3 討論

BM-MSCs 因其來源方便，能實現體外增殖和培養，同時又具有多向分化潛能，并且避免了倫理沖突[14]，在臨床上具有很大的疾病治療潛力。其主要作用機制在于通過誘導神經營養因子的分泌，直接促進軸突生長，與靶細胞重新建立聯系；或間接誘導星形膠質細胞活化，進而促進神經再生和修復[15]；此外BM-MSCs也具備橫向分化潛能，在神經營養因子誘導作用下，少部分BM-MSCs 在體內可分化為神經外胚層樣細胞，但是仍有大部分BM-MSCs 分化為星形膠質細胞[16]。因此在應用BM-MSCs 時，體外成功將其定向分化的技術至關重要，這在很大程度上影響疾病的治療效果。目前，國內外學者主要采用化學誘導法（β-巰基乙醇、全反式視黃酸）和Transwell 小室共培養法將BMMSCs在體外定向誘導分化成神經元樣細胞[17]。本研究利用β-巰基乙醇，全反式視黃酸和Transwell 小室共培養3 種誘導方式誘導7 d 后，各組BM-MSCs逐漸向典型神經元的形態特征發生變化，提示3 種誘導方式都可以成功誘導BM-MSCs 向神經元樣細胞表型轉化，形成軸突和樹突。但是通過免疫組化法檢測不同誘導條件下神經元特異性烯醇化酶陽性表達率發現，β-巰基乙醇誘導分化組神經元特異性烯醇化酶陽性表達率高于其他三組（P<0.05），故而選擇β-巰基乙醇定向誘導分化7 d 后的BM-MSCs 用于后續動物實驗。

全反式視黃酸是維生素A 的主要活性代謝產物[18]。本研究結果顯示，在3 種誘導方法下，全反式視黃酸誘導分化的神經元所占比例最低，與其在大鼠骨髓基質細胞的成骨分化作用中類似[19-20]。全反式視黃酸誘導分化骨髓間充質干細胞的作用原理可能與激活BMP 信號通路有關。其通過上調負責成脂分化的BMP 受體IA 的表達，從而促進骨髓間充質干細胞的成脂化，所以降低了向神經元樣細胞的分化[21]。Transwell 小室共培養法是通過細胞與神經細胞之間的相互接觸、相互支持的特異空間結構促進骨髓間充質干細胞分化為神經細胞。本研究中，Transwell 小室共培養法誘導分化的神經元比例較高，這可能是因為共培養中神經細胞分泌的各種細胞因子[22]、神經遞質[23]等促進了BM-MSCs 向神經元樣細胞的分化。共培養法的機制使骨髓間充質干細胞置于一種更接近人體的微環境中，誘導其向神經細胞分化。β-巰基乙醇是研究較早且較為成熟的一種分化誘導劑，通過提高胞質內抗氧化成分-谷胱甘肽的水平降低氧自由基的生成量以達到誘導細胞分化的目的[24]。關寧等[25]研究顯示，β-巰基乙醇組神經元特異性烯醇化酶陽性率和微管相關蛋白分化率更高，說明相較于神經生長因子，β-巰基乙醇能夠更好地促進BM-MSCs 向神經元樣細胞分化。本研究結果顯示，β-巰基乙醇通過提高神經分化標志物GFAP、NT3、MAP2、Tau、CXCR4、N200、NESTIN、UBIQUITIN、TUBULIN Ⅲ等特異性蛋白的表達量，刺激胞體和樹突發育，提高神經元存活數量，與鄰近的細胞間形成突觸連接，進而形成穩定的神經元細胞。

此外本研究進一步通過大鼠實驗證實，普通細胞組和定向誘導組大鼠運動功能較模型組大鼠明顯改善，無論是注射BM-MSCs 還是注射神經元樣向誘導分化的BM-MSCs，都具有恢復大鼠坐骨神經電生理學特性和拉伸力學性能的作用。而且坐骨神經損傷處神經生長相關因子（BDNF、MBP、GAP-43 蛋白）的表達水平明顯升高。定向誘導組大鼠SFI 指數、BBB 評分、肌濕重恢復率高于普通細胞組（均P<0.05），提示BM-MSCs 可以向神經損傷點傳遞有助于功能恢復的關鍵信號，進而改變細胞行為或轉移某些細胞因子以減輕損傷。而且神經元樣定向誘導分化的BM-MSCs更有利于坐骨神經損傷的恢復。

綜上，β-巰基乙醇可定向誘導BM-MSCs 向神經元樣細胞分化，能夠獲得穩定的神經元細胞。在坐骨神經損傷處注射定向誘導為神經元樣細胞的BMMSCs 具有明顯的神經損傷修復作用，可促進神經元再生。從而證實利用成體干細胞（大鼠BM-MSCs）誘導神經元樣定向分化作為一種簡便的治療方法用于周圍神經系統疾病的可能性。