miR-34a及其下游因子Bcl-2、TGF-β1在膽管癌發展中的作用

徐志誠 陳曉寧 李春海 王曉東

6月-2018年6月86例本院收治的膽管癌患者（試驗組）及86例健康人（對照組）的資料，并取其血清利用實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）測試miR-34a表達水平，同時檢測調控因子Bcl-2、TGF-β1的表達量。結果：試驗組miR-34a、Bcl-2及TGF-β1表達量均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.001）;不同miR-34a表達程度膽管癌患者性別、年齡、分化程度比較，差異均無統計學意義（P>0.05）;miR-34a高表達患者TNM分期、Bcl-2、TGF-β1與miR-34a低表達患者比較，差異均有統計學意義（P<0.001）。試驗組化療后miR-34a、TGF-β1及Bcl-2表達量均明顯低于化療前，差異均有統計學意義（P<0.001），膽管癌患者血清miR-34a與Bcl-2、TGF-β1均呈正相關（r=0.872、0.876，P=0.041、0.003）。結論：膽管癌患者miR-34a表達量明顯高于健康人，可能與調控下游Bcl-2、TGF-β1的表達量有關，此外miR-34a、Bcl-2及TGF-β1隨患者的治療活動變化產生相應改變，可見三者可作為膽管癌診療的潛在位點。

【關鍵詞】 膽管癌 調控網絡 化療治療 相關性分析

[Key words] Cholangiocarcinoma Regulatory network Chemotherapy Correlation analysis

First-author’s address： Jiamusi Central Hospital， Jiamusi 154002， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.18.035

膽管癌是一種源于肝外膽管的惡性腫瘤，且近年來發病率逐漸上升[1-2]。目前臨床上外科手術是治療該病的主要方法，但是到了癌癥晚期，腫瘤分化程度高，手術治療效果往往較差，而化療成為治療該病晚期主要的治療方法[3]。然而，大量研究報道，膽管癌患者對化療不敏感，且治療效果較差，可能與miR-34a及其下游調控的Bcl-2、TGF-β1因子存在密切相關性[4-5]。故研究miR-34a在膽管癌患者的表達及其化療前后變化，在一定程度上可提高患者的臨床治療效果并對患者的遠期預后具有重大的意義。鑒于此，本中心分析miR-34a及其的下游Bcl-2、TGF-β1因子的表達及其化療前后變化，為臨床進一步提高膽管癌的治療提供新的理論依據和研究方向。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年6月-2018年6月本院收治的86例膽管癌患者（試驗組）及同期于本院體檢的86例健康人（對照組）的資料。納入標準：經病理證實為膽管癌;年齡25～75周歲;無其他遠處轉移。排除標準：合并其他重大器官功能不全;免疫功能缺陷;存在惡病質。入選人員收集資料均完整，且知情并同意本次研究，并通過本院倫理委員會的認證。

1.2 實驗試劑與儀器 試劑：miR-34a（上海吉瑪科技有限公司），細胞裂解液（美國Initrogen公司），miR-34a提取分離試劑盒（北京天根生化科技有限公司），miR-34a逆轉錄引物及逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司），Bcl-2、TGF-β1試劑盒（Santa公司，美國）。儀器：實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）儀（美國ABI公司），低溫高速離心機（美國Eppendorf公司），酶聯免疫吸附法試劑盒（Infinite F 50，帝肯公司，瑞士）

1.3 方法 （1）miR-34a的提取：取兩組清晨空腹靜脈血各5 mL，離心分離后取血清，加入等體積的細胞裂解液。再12 000 r/min離心10 min加入氯仿。然后進行震蕩，12 000 r/min離心30 s，取水相層，并加入其1/3的無水乙醇，倒入吸附柱，再進行12 000 r/min離心30 s。重復過柱遴選后，加入500 μL去蛋白液，再進行12 000 r/min離心30 s。而后加入漂洗液，進行12 000 r/min離心120 s，向吸附柱中加入30 μL去離子水，在室溫下放置12 s后，再進行12 000 r/min離心120 s得到miR-34a。（2）qRT-PCR：反應條件為95 ℃，10 s、20 s;62 ℃，40 s，共40個循環，采用相對定量法測試miR-34a的表達量。獲取兩組研究對象的外周靜脈血5～7 mL，加入抗凝管，然后放入離心機，3 000 r/min的速度離心，分離上清液，放入-80 ℃保存備用。具體操作方法按照試劑盒的方法操作進行Bcl-2、TGF-β1的檢測。（3）化療藥物：吉西他濱（生產企業：ELI LILLY AND COMPANY，批準文號：注冊證號H20110535，規格：200 mg）進行化療。（4）測定miR-34a的表達量高于中位數的定義為高表達，低于中位數的定義為低表達。

1.4 觀察指標 比較兩組miR-34a、Bcl-2及TGF-β1表達量，比較不同miR-34a表達情況膽管癌患者臨床資料，比較試驗組化療前后miR-34a、Bcl-2及TGF-β1表達量，分析miR-34a與其下游因子的相關性。

1.5 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗;采取Pearson相關分析評價miR-34a與其下游因子的相關性。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 試驗組，男49例，女37例;年齡37～59歲，平均（48.24±7.23）歲。對照組，男48例，女38例;年齡37～60歲，平均（48.31±7.35）歲。兩組性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組miR-34a、Bcl-2及TGF-β1表達量比較 試驗組miR-34a、Bcl-2及TGF-β1表達量均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.001），見表1。

2.4 試驗組化療前后miR-34a、Bcl-2及TGF-β1表達量比較 試驗組化療后miR-34a、TGF-β1及Bcl-2表達量均明顯低于化療前，差異均有統計學意義（P<0.001），見表3。

3 討論

膽管癌是常見的惡心腫瘤之一，其主要的臨床表現為黃疸、膽囊腫大、肝臟損害、膽道感染和出血等，嚴重危及患者的生命安全[6]。有研究報道，該病病因可能與膽管結石、原發性硬化性膽管炎等疾病有關，目前臨床上治療該病的方法有手術治療、放射治療、化學治療等方法，其中手術治療是針對早期病例的有效治療方法，而放射治療、化學治療是針對膽管癌晚期患者的治療方法[7-8]。但文獻[9-10]報道，膽管癌晚期患者進行化療時，往往效果較差，患者的耐藥性較差，嚴重影響治療效果，因此探究膽管癌患者弱化療性的原因對膽管癌患者具有重大的臨床意義。

目前miR-34a為多種腫瘤的有效診斷指標之一。此外同時有研究報道，膽管癌的發生發展及轉移性與miR-34a關系密切[11-12]。而最新的研究也證實了miR-34a同樣參與了膽管癌患者對化療藥物的耐藥性[13]。

上皮間質轉化（EMT）已經被證實參與多種癌癥的發生，如乳腺癌、子宮頸癌、肝細胞癌等，而上皮間質轉化同樣參與了膽管癌的發生。而miR-34a通過調節其下游的TGF-β1的過表達，誘導了腫瘤的發生并促進了EMT的發生從而參與了膽管癌的發生發展及轉移。而本研究結果也證實了膽管癌患者血清miR-34a和TGF-β1的表達量均高于健康人群，此外，miR-34a表達與TNM分期有密切的關系，且隨著膽管癌患者臨床分期的進展，miR-34a表達逐漸升高。證實了miR-34a和TGF-β1參與了膽管癌的病理過程，佐證了既往的研究[14]。

而Bcl-2作為調控抗凋亡蛋白家族成員，其量的過度表達同樣參與了膽管癌的轉移。而本研究結果也提示膽管癌患者的血清Bcl-2高于健康對照組，同時了證明了之前研究關于Bcl-2參與了膽管癌發展的結論[15]。

同樣有研究證實了miR-34a參與了膽管癌抗化療性，其同樣TGF-β1和Bcl-2來實現的，前者是通過EMT獲得了間葉細胞的侵襲能力來降低化療藥物的敏感性，而Bcl-2則通過抗凋亡作用來降低膽管癌細胞對化療藥物的耐藥性[16]。而本研究結果顯示化療前后上述三項指標均較治療前降低，與既往的研究結果相似[17]。

最后，本研究結果顯示miR-34a與Bcl-2、TGF-β1均呈正相關（P<0.05），足見miR-34a通過一系列機體內的生物信號傳導途徑，達到了調控Bcl-2、TGF-β1量的目的，最終實現了調控膽管癌發生發展以及對抗化療藥物的生物效應，既往的研究也得出類似的研究結論[18]。

綜上所述，miR-34a通過調控機體Bcl-2及TGF-β1的過表達參與了膽管癌的發生及預后，其可作為臨床評估膽管癌診療的重要指標，有成為膽管癌治療靶點的潛在可能。但本研究為單中心研究且研究個體量偏少，需要多中心聯合大樣本量來進一步證實miR-34a在膽管癌的角色定位。另外，microRNA的進一步分類研究也是下一步的研究重點。

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（收稿日期：2020-08-17） （本文編輯：程旭然）