類風濕關節炎中的外泌體及其作用研究進展

孫 勇 趙 創 劉志丹

1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院寶山分院康復醫學科，上海 201999；2.上海市寶山區中西醫結合醫院康復醫學科，上海 201999；3.上海中醫藥大學附屬曙光醫院寶山分院針灸科，上海 201999

近些年來，外泌體越來越受到研究者們的關注。最初，它們被認為是無用的細胞代謝廢物，但在隨后的研究中逐漸發現外泌體能通過轉移蛋白、脂質、編碼RNA、非編碼RNA 等物質至靶細胞或分子發揮作用。對于類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）而言，外泌體既可以是致病原因，也可以是疾病的生物標志物，還可以是治病的工具和手段。本文就這幾方面問題進行了回顧和梳理。

1 RA 的生物標志物

近年研究發現：外泌體的內容物包括核酸、蛋白質、各種微RNA（microRNA，miRNA）、DNA 及多種脂質物質，例如神經酰胺、鞘磷脂-髓磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺和膽固醇等。外泌體攜帶的一部分內容能反映親代細胞的生理或病理狀況[1]，因此外泌體可作為疾病診斷的生物標志物。

研究顯示，RA 中外泌體來源的miR-424[2]、miR-221-3p[3]、miR-223-3p[4]高表達，miR-548a-3p[5]、miR-1915-3p[6]低表達，均可作為本病的潛在標志物。RA患者血液單核細胞和血清外泌體中同源框轉錄反義RNA（homehox transcript antisense RNA，HOTAIR）高表達[7]，導致活躍的巨噬細胞遷移；相反，在分化的破骨細胞和滑膜細胞中檢測到顯著較低水平的HOTAIR。蛋白質質譜分析[8]在活動性RA 患者中鑒定出的Toll 樣受體3 則呈現異常的高表達，提示RA 血清外泌體中含炎癥相關蛋白，在RA 發病過程中有重要作用。

2 促炎作用

2.1 分泌促炎性細胞因子

機體的炎癥過程受致炎和抑炎細胞的動態平衡調節。外泌體介導了細胞與細胞間交流，促進了炎癥因子的分泌，從而引起了炎癥的發生。

研究顯示，RA 患者體內的外泌體可抑制CD8+T細胞、B 細胞、自然殺傷細胞的增殖，促進Treg 細胞的分化，抵御巨噬細胞引起的炎癥反應，促進Th1細胞的增殖[9]。血小板來源的外泌體[10]和膠原蛋白、膠體蛋白相互作用后可以表達白細胞介素（interleukin，IL）-1，從而導致成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocyte，FLS）釋放的IL-6 和IL-8 增加。PEV 進入發炎關節后，其磷脂膜被轉化成促炎介質12 羥基二十碳四烯酸，再次加劇炎癥。同時，外泌體將血小板磷脂膜釋放的花生四烯酸運輸到血小板和內皮細胞，從而誘導環氧化酶2 和凝血素A2 的生成，同時活化血小板、促進合成前列腺環素-2，進一步加重RA 進程。RA 患者滑膜液和滑膜成纖維細胞的外泌體中含有大量的DNA 結合/分化抑制因子1，它能促進成纖維細胞增生、抑制IL-6 和IL-8 的分泌，參與RA 的發病機制[11]。

2.2 表達特殊的膜蛋白

在過去的20 年里，大多數外泌體的研究都集中在核酸組成和鄰近細胞轉移。然而，外泌體也攜帶特殊的膜蛋白，可以識別其親代細胞的生理和病理狀態。有研究[12]顯示：膜結合形式的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 存在于RA 患者滑膜成纖維細胞外泌體中，而在骨關節炎患者滑膜成纖維細胞外泌體中未見膜結合形式的TNF-α。RA 滑膜成纖維細胞外泌體被抗CD3 激活的T 細胞有效地吸收，激活蛋白激酶和核因子κB，誘導膠原酶-1 產生，從而促進炎癥，并使這些活化的T 細胞具有抗凋亡的能力。

2.3 釋放促炎miRNA

miRNA 不僅存在于細胞內發揮著生物學功能，也存在于細胞分泌的外泌體中；細胞內的miRNA 也可以跟隨外泌體的釋放進入或影響其他細胞，從而發揮生物學功能。

例如：外泌體來源的miR-21 和miR-29a 能夠通過與這些細胞中的Toll 樣受體7 相互作用激活小膠質細胞、巨噬細胞和神經元，從而導致促炎性細胞因子如TNF-α 和IL-6 的分泌，加重RA 炎癥[13]；樹突狀細胞來源的外泌體miR-155 及miR-146a 可介導FLS 與其他免疫細胞間的信息交流與物質交換，從而調控RA 的疾病進程[14]；巨噬細胞和FLS 釋放含有miR-let-7b 的外泌體，進入發炎關節的髓樣細胞連接Toll樣受體后，誘導髓樣細胞分化為M1 巨噬細胞，進而釋放TNF、IL-1、IL-6 等一些促炎性細胞因子，加重RA 關節炎癥[15]；外泌體攜帶的miR-17通過抑制轉化生長因子受體Ⅱ表達來抑制Treg 細胞的分化，促進RA 的發展[16]。

3 骨破壞作用

骨代謝是一個機體中破骨效應和成骨效應此消彼長的過程。RA 中的骨破壞作用主要體現在軟骨組織的破壞、破骨細胞的增多從而影響骨形成和促進骨吸收兩方面。

破骨效應方面，有研究[17]顯示，RA 機體中軟骨組織和軟骨細胞中丙酮酸脫氫酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4）低表達，miR-106b 是PDK4的上游調控因子，且在RA 滑膜成纖維細胞和滑膜成纖維細胞衍生的外泌體中高表達。miR-106b通過外泌體從SFs 傳遞到軟骨細胞，抑制軟骨細胞增殖和遷移，加速細胞凋亡，并通過下調PDK4 影響核因子κB配體/RANK/骨保護素系統。

在骨形成和吸收方面，據報道[18]，破骨細胞miR-214-3p 的增加與老年骨折女性血清miR-214-3p 升高及卵巢切除小鼠的骨形成減少有關，靶向抑制破骨細胞miR-214-3p 可促進老齡卵巢切除大鼠的骨形成。表明含有miR-214 的破骨細胞衍生外泌體能抑制成骨細胞活性，在破骨細胞中抑制miR-214-3p可能是治療諸多骨形成減少的骨骼疾病的一種策略。

4 抑炎作用

除了上述促炎作用，外泌體及其衍生物在不同環境條件下，還可能起抑炎作用。

首先，一部分外泌體可分泌miRNA 抑制炎癥。例如：含有miR-150-5p 的間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）衍生的外泌體能下調基質金屬蛋白酶14 和血管內皮生長因子的表達，通過下調滑膜細胞增殖和血管生成來減少關節破壞[19]；miR-320a 的MSC 源性外泌體顯著抑制RA-FLS 的激活、遷移和侵襲，并減輕膠原誘導的關節炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠的關節炎和骨損傷[20]；RA 患者的血清外泌體中miR-6089 顯著降低，而miR-6089 可抑制炎癥細胞因子如IL-6、IL-29 和TNF-α 的分泌，間接介導了炎癥反應[21]；外泌體來源的miR-192-5p 可通過靶向RAC2 在體外抑制炎癥和減輕RA 癥狀[22]。

另外，部分外泌體本身能抑制炎癥因子或效應性T 細胞。例如：MSCs 來源的外泌體可以抑制CD4+和CD8+T 細胞的增殖，可在遲發型過敏小鼠模型中發揮抗炎效應，同樣在CIA 模型中也能減緩炎癥[23]；來自轉化生長因子基因修飾的樹突狀細胞的免疫抑制性外泌體能夠減弱小鼠Th17 介導的炎癥[24]，全身注射該類型外泌體是一種有效的治療，有研究已建立的鼠類CIA 治療方法[25]；來自人MSC 的外泌體對T 細胞分化和激活具有抑制作用，并能減少γ 干擾素釋放[26]，對適應性免疫和先天性免疫均具有抑制和調節作用，從而促進關節組織修復。

5 軟骨修復作用

RA 的主要特征是關節滑膜的炎癥和軟骨、骨進行性破壞，如果能有效阻止骨破壞、促進軟骨修復，則將有益于RA 的轉歸。

RA-FLS 衍生的外泌體中miR-486-5p 靶向Tob1，并激活成骨細胞中的BMP/Smad信號通路，促進成骨細胞分化。含有miR-486-5p 的RA-FLS 衍生的外泌體通過降低CIA 誘導的小鼠中的Tob1 表達來減輕RA 的骨質破壞[27]。

大鼠股骨遠端滑車溝的軟骨缺損處注射人胚胎MSC 來源的外泌體可以完全修復軟骨及軟骨下骨[28]，恢復透明軟骨良好的表面規則性，使其與鄰近軟骨完全結合。這說明該外泌體作為一種現成的、無細胞的治療方法可以替代基于細胞的MSC 治療。

使用患者脂肪干細胞（adipose-derived stem cell，ADSC）分離外泌體與活化的滑膜成纖維細胞共培養[29]，結果顯示促炎的IL-6、核因子κB 和TNF-α 表達下調；外泌體處理可保護關節軟骨細胞免受過氧化氫誘導的凋亡。此外，外泌體處理促進骨膜細胞的軟骨生成，增加軟骨生成標志物，包括Ⅱ型膠原和β-catenin并表達較高水平的miR-145 和miR-221。這說明患者來源的ADSCs 產生的外泌體，可作為潛在的用于軟骨再生和治療骨關節炎的工具。

6 遞送藥物的載體

為了在恰當的時機將適量的藥物遞送到正確的位置，目前研究者正積極探索在空間、時間及劑量上調控藥物生物體內分布的技術體系，即藥物遞送系統，以增加藥物的利用效率、提高療效、降低成本、減少毒副作用。近年來，多種納米尺度載藥體被用于臨床，但因為材料和載體的安全性、免疫原性及網狀內皮系統或單核吞噬細胞系統的快速清除作用，導致應用上的局限。

外泌體是一種有前途的治療方法[30]，其具有天然、體積小、穩定性好、生物活性高、體內生物相容性好、靶向性強、毒性或免疫原性低、長期可維護性、免疫排斥反應低的優點。外泌體作為細胞間通信的主要參與者，不同的材料（例如蛋白質、miRNA、mRNA 等）可有效地包裝在外泌體中并轉移到其他細胞中。

例如，為了克服糖皮質激素全身給藥后分布不明確、長期給藥時出現嚴重不良反應的問題，有研究者設計了以葉酸-聚乙二醇-膽固醇復合物修飾表面的仿生外泌體包埋地塞米松磷酸鈉的納米顆粒FPCExo/Dex[31]，并建立主動靶向給藥系統。體外實驗顯示：該系統通過抑制促炎性細胞因子和增加抗炎細胞因子，增強了對RAW264.7 細胞的內吞作用和抗炎作用。FPC-Exo/Dex 能有效地在炎癥部位聚集，體內生物分布實驗表明：FPC-Exo/Dex 能較好地保護CIA 小鼠的骨和軟骨，并能顯著減輕關節炎。體內安全性評價表明，這種仿生給藥系統沒有明顯的肝毒性，具有良好的生物相容性。

單核細胞來源的髓樣細胞在炎癥相關的自身免疫/炎癥性疾病和癌癥中起著重要作用。有研究報道[32]：外泌體可以在體內向激活的髓樣細胞傳遞諸如姜黃素之類的抗炎藥。這項技術為諸如姜黃素等藥物提供了一種手段，既可以針對炎癥細胞，也可以避免不必要的非靶向效應。且利用外泌體作為傳遞載體，可以在血液中提供更穩定、更高濃度的姜黃素。

用編碼FasL 的重組腺病毒體外轉染DC 可促進外泌體的產生，該外泌體具有抑制DTH 模型中炎癥進展并減輕CIA 動物模型的癥狀。以類似的方式，從表達IL-4 的DC 中分離出的外泌體能夠抑制DTH 小鼠模型中已建立的CIA 癥狀并減輕炎癥的嚴重程度。此外，與親代DC 比較，DC 的外泌體產生了相似或改善的治療結果。這些結果表明，外泌體是用于遞送治療炎性疾病的生物試劑的有效納米載體[33]。

另外在遞送miRNA 方面，研究顯示：B 細胞衍生的外泌體是遞送miRNA-155 抑制劑的理想候選藥物[34]；人MSC 產生的高表達miRNA-124a 的外泌體，能夠抑制細胞增殖、遷移并促進成纖維樣滑膜細胞株的凋亡[35]。這都說明外泌體是遞送治療性miRNA 的理想載體，有望為治療RA 提供新的方法。

7 小結

外泌體在RA 中的“一正一反”的兩種不同作用逐漸被人們認識和重視，作為細胞間的“通信兵”，它也在RA 的診斷和治療中顯示出廣闊的前景。外泌體蛋白和核酸等活性物質可以作為疾病診斷的標志物，為將來的體外診斷奠定了基礎，但是究竟哪些是最佳的標志物、如何優選高效的外泌體分離方法并降低其經濟成本是未來需要攻克的難題。

外泌體作為可以運輸靶向藥物的天然載體，具有穩定性好、生物活性成分高、靶向性強、毒性或免疫原性較低等優點，在RA 治療領域大展拳腳并逐漸走向臨床。來自人脂肪MSC 的外泌體已表現出對T 細胞分化和激活的抑制作用，人母乳中的外泌體可以在體外誘導Treg 細胞并抑制效應T 細胞活化從而治療RA，這讓人們看到了人工合成品甚至是天然獲得的外泌體在治療RA 方面的美好前景。