環狀RNA在腫瘤耐藥中的應用*

蔣燦燦，周淑萍

[安徽理工大學第一附屬醫院(淮南市第一人民醫院)，安徽 淮南 232000]

癌癥作為世界性公共衛生健康威脅的主要原因之一，具有高病死、高復發、高轉移和預后差等特點。根據2018年全球癌癥統計，全球新增癌癥病例1 810萬例，死亡的病例數高達960萬[1]。盡管手術切除、放化療、免疫治療、內分泌治療及靶向治療等臨床應用手段在癌癥的治療方面取得了一定進展,但癌癥患者的存活率仍然較低，造成這一后果的原因多是早期診斷率低及無有效的預后評估手段。目前抗癌常用的治療藥物和方案包括：索拉非尼、阿霉素(Adriamycin,ADM)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)、含鉑抗癌藥物、免疫治療等[2-5]。這些傳統療法仍是現今主要治療形式，但這些藥物在治療后期多會使癌細胞產生藥物抵抗，并由此產生治療成功率降低，預后不佳的后果。腫瘤藥物治療過程中出現的耐藥機制繁而復雜，目前研究出的可能機制包括腫瘤干細胞非正常性激活、化療藥物代謝速度增加、DNA損傷后修復能力增強、細胞凋亡信號通路活性喪失、細胞內藥物積聚被重新分布及轉運體(識別和排出藥物)的表達增加等[6-8]。

環狀RNA是一種內源性RNA，由前體RNA經反向剪接或選擇性剪接形成的單鏈環狀結構，其特征是在真核生物中具有較高的序列保守性、表達特異性及高度穩定性等。與其他線性RNA相比，環狀RNA所特有的閉合環狀結構，使其無游離端，不易被核糖核酸酶剪切，難以被許多典型的RNA降解途徑降解，故可在體內穩定存在[9]。研究表明，大多數已測序的環狀RNA比線性RNA具有更長的半衰期，特別是在永久性細胞中，例如，隨著年齡的增長，環狀RNA會在神經細胞中大量富集[10-13]。此外，一些環狀RNA可以促進或者抑制靶基因的表達，這主要是因為其部分片段上含有與miRNA相結合的位點，可通過堿基互補配對原則結合miRNA，阻止miRNA與目標基因結合，共同調控靶基因的表達[14-15]。目前已證實體內的miRNA可調節幾十到上百個基因的表達，以及同時控制多個細胞途徑的下傳，在基因組中起主要調節作用。在癌細胞中，一些miRNA的調控作用經常被解除，隨之出現細胞原癌基因逃脫miRNA介導的抑制，獲得獨立于原癌基因本身的突變功能[16-17]。隨著對miRNA研究的深入，已發現miRNA不僅在癌組織和細胞中差異性表達(上調或下調)，并且還參與癌細胞的生長浸潤、遠處或多處轉移、細胞耐藥等[18-22]。基于miRNA的一系列作用，有研究者提出構建miRNA模擬物作為治療腫瘤的藥物，系統或局部地將模擬物注射到目標組織部位，但血流中易降解，靶向性不佳以及局部傳遞困難等問題，是目前需要面對的挑戰[23]。與miRNA易降解、壽命短、不穩定等缺陷相比，環狀RNA不僅可在體液(唾液、血液及組織液)中穩定存在，而且具有復制保守性。因此通過circRNA/miRNA軸改變靶基因的表達量，糾正細胞缺陷所致的癌細胞過度增殖，并促進凋亡途徑的激活以及癌細胞死亡，是目前科研工作中需考慮的方向之一。除此之外環狀RNA還有蛋白質翻譯、基因轉錄及轉錄后修飾等作用[14,24-26]。針對環狀RNA特有的結構、功能及作用機制，其有成為腫瘤預防、早期診斷、治療靶點確認、療效評估及預后評估的分子標志物的潛力。

1 環狀RNA的生物學特征

早在20世紀70年代，Kolakofsky首次在仙臺病毒中發現了單鏈的、閉合環狀的、無蛋白質外殼的一種RNA分子，但因認識的不足，以及測序技術的匱乏，最初認為其是轉錄過程中錯誤拼接的產物，隨著高通量測序技術及生物信息技術的快速發展，才改變對環狀RNA結構的錯誤認知[27]。環狀RNA除了多數來自外顯子外，還有少部分分別源于3'UTR、5'UTR、內含子、基因間區以及反義RNA。根據環狀RNA的組成序列及結構的不同，可將其分為外顯子circRNA、內含子circRNA、外顯子-內含子circRNA和基因間型circRNA，其中，外顯子RNA占據所鑒定出的circRNA的80 %[28-29]。科研工作者在對環狀RNA的生物學特性，及其在腫瘤發生及發展中所發揮的作用進行了一系列研究后，提出了以下幾點認識：首先，環狀RNA幾乎在所有的組織和細胞中都差異性表達，包括肺癌、胃癌及泌尿道腫瘤等[30-34]；其次，同一腫瘤中，不同的circRNA表達方式也存在差異，而簡單的上下調方式已難以滿足其表達需要，例如在胃癌中，circHIPK3和circPVT1表達上調[30-31]，而circLARP4表達下調[32]；第三，相同環狀RNA在不同腫瘤中表達也不相同，并且其上下調模式也不相同，例如，circHIPK3在絕大多數癌癥中的表達都是上調的[30,33]，但在膀胱癌中它是下調的[34]。具有復雜表達模式的環狀RNA，在生物學功能及臨床應用中也展示了其復雜的一面。環狀RNA除了調控腫瘤生長浸潤、遠處或多處轉移以及腫瘤周圍血供增加等作用外，還與癌癥的各種臨床表征及患者預后相關[35-36]。環狀RNA與腫瘤臨床治療的相關性提示了其潛在的臨床診斷價值，例如，低表達的circNOL10可能暗示該肺癌惡性程度不高，預后良好[37]；而circDONSON的高表達則提示該胃癌患者出現淋巴結轉移，需加強重視[38]。綜上所述，環狀RNA在腫瘤的早期診斷、治療及預后中有重大意義。

2 環狀RNA與藥物耐藥

目前，靶向治療、化療、免疫治療及內分泌治療等仍是癌癥相關疾病藥物治療的主流。如分子靶向藥物常用藥劑包括索拉非尼、瑞格拉非尼等。而常用的臨床化療藥物有阿霉素、5-氟尿嘧啶、順鉑和奧沙利鉑。至于腫瘤的免疫治療，它是一種新的治療選擇，主要包括免疫檢查點阻滯劑：程序性死亡受體-1(Programmed Cell Death-1,PD-1)、程序性死亡受體配體-1(Programmed Cell Receptor-ligand 1,PD-L1)等。而腫瘤的內分泌治療則主要是針對雄激素及雌激素受體的藥物，其中廣泛使用的藥物為苯扎魯胺、他莫昔芬等。

環狀RNA是作為一種內源性RNA，在體內大量富集，并可能以差異性表達的方式在組織和細胞中存在。最近，環狀RNA被證明在一些細胞生長的各個過程中發揮調節作用，如miRNA“海綿”、RBP結合分子、轉錄調節因子、蛋白質翻譯以及免疫調節因子等[39-40]。新的證據表明環狀RNA除了調控腫瘤生長、轉移以及增加血供等作用外，還與癌癥的各種臨床表征及患者預后相關。本文從腫瘤耐藥的角度探討環狀RNA的作用、功能及機制，以期為臨床治療提供新思路。

2.1環狀RNA與阿霉素耐藥 阿霉素作為抑制細胞周期的抗癌藥物，在臨床上廣泛使用，其潛在作用為:抑制DNA復制合成，干擾復制所需的拓撲異構酶Ⅱ活性，并參與誘導線粒體自由基損傷等[41-42]。在多種癌癥的黃金治療方案中，阿霉素是治療的關鍵要素之一，然而，其抗癌作用隨著長期暴露于濃度梯度中而逐漸減弱，最終形成多藥耐藥[43-44]，但隨著對環狀RNA的了解愈加深入，其在阿霉素耐藥方面存在的潛在臨床診療價值也隨之彰顯。有研究者在乳腺癌患者的癌細胞中發現了一種名為circKDM4C的環狀RNA，此命名是因其來源于賴氨酸去甲基化酶4C(Lysine Demethylase 4C,KDM4C)基因。體內外實驗中證實了在乳腺癌細胞和組織中circKDM4C的表達較正常細胞和組織下降，并且其低表達會影響乳腺癌的預后和轉移。通過流式細胞儀和Western印跡分析得出，circKDM4C基因敲除可抑制阿霉素誘導的細胞凋亡，而circKDM4C過表達可促進細胞凋亡。進一步的實驗得出，低表達的circKDM4C可通過與miR-548p相互作用，抑制靶基因吩嗪生物合成類蛋白質結構域(Phenazine Biosynthesis Like Protein Domain Containing,PBLD)的表達，最終導致病情進展以及化療耐藥性增強。此研究提出了乳腺癌患者潛在的治療靶點可能是circKDM4C/miR-548p/PBLD軸[45]。此外，骨肉瘤患者的組織、血液和化療耐藥細胞中，circPVT1顯著上調，但敲除circPVT1后可降低經典耐藥相關基因ATP結合盒轉運體B1(ATP Binding Cassette Transporter B1,ABCB1)的表達，從而增加了骨肉瘤細胞對阿霉素和順鉑的敏感性[46]。在不影響體內其他RNA表達的情況下，若能精準調控致癌環狀RNA，使其轉變為具有治療意義的RNA藥物。如上述，circPVT1在非小細胞性肺癌及骨肉瘤中表達上調則會導致多重耐藥，若研發一種能靶向于circPVT1的RNA藥物抑制其表達，便可解決腫瘤細胞或組織的耐藥性問題[46-47]。

2.2環狀RNA與5-氟尿嘧啶(5-FU)耐藥 5-氟尿嘧啶(5-FU)是一種細胞周期抗代謝化療藥物，其抗癌機制為：干擾DNA合成，促使細胞周期停滯等[48]。在5-FU耐藥的乳腺癌(Breast Cancer,BC)細胞中，存在顯著差異性表達的是：CDR1as(上調)以及miR-7(下調)，并且miR-7是CDR1as的靶基因之一，二者可共同調控周期蛋白E1(Cyclin E1,CCNE1)的表達，過表達miR-7或者沉默CDR1as都可增加5-FU耐藥BC細胞的化療敏感性，上述結論可表明CDR1as可能是確定和優化乳腺癌治療策略的潛在工具[49]。此外，有研究者發現，與5-FU敏感大腸癌組織及細胞相比，在5-FU耐藥的大腸癌中，circ-PRKDC和FOXM1的表達升高，miR-375的表達較正常組織和細胞明顯下調，而沉默circ-PRKDC或過表達miR-375、FOXM1都可增加耐5-FU大腸癌細胞的敏感性，進一步的研究表明，敲除circ-PRKDC基因后可調控miR-375/FOXM1軸，抑制Wnt/β-catenin通路，增強5-FU耐藥細胞對5-FU的敏感性[50]。

2.3環狀RNA與鉑類藥物耐藥 鉑類藥物，包括順鉑及奧沙利鉑等，作為一種廣譜抗腫瘤藥，主要抑癌功能為：抑制DNA合成和轉錄，是癌癥治療最常用的藥物之一[51-52]。順鉑由Michele Peyrone合成，首先是用作睪丸癌和卵巢癌的治療藥物。在對順鉑耐藥和順鉑敏感的胃癌組織進行RNA測序后，得出circAKT3在順鉑耐藥胃癌組織中顯著表達，而與其結合的miR-198表達水平下降。功能學實驗發現，circAKT3/miR-198軸靶向調控目的基因PIK3R1的表達后，激活相關信號通路PI3K/AKT，最終增加胃癌細胞對順鉑的耐藥性[53]。相關研究證明，乳腺癌易感基因1(Breast Cancer Susceptibility Gene 1,BRCA1)作為DNA修復分子，可通過激活PI3K/AKT通路促進其表達，此信號通路還可增加以順鉑為基礎的DNA損傷化療藥物的耐藥性，表明circAKT3可作為良好生物標志物，用于預測胃癌患者是否出現順鉑耐藥[54]。不同的環狀RNA在同一組織或細胞中具有不同表達模式，例如，同是順鉑耐藥的胃癌組織，circCUL2的含量較正常組織顯著減少，而其下調可能代表著癌細胞增殖、遷移、侵襲和耐藥的增強。進一步的實驗表明，miR-142-3p與circCUL2、Rho相關卷曲螺旋形蛋白激酶2(Rho-associated Coiled Coil-containing Protein Kinase 2,ROCK2)的表達水平呈負相關，而circCUL2與ROCK2的表達水平呈正相關。在上調circCUL2的順鉑耐藥細胞中檢測到表達增加的ROCK2，這表明ROCK2可能是circCUL2通過結合miR-142-3p促進順鉑耐藥胃癌細胞自噬的靶基因的表達產物[55]。此外，與順鉑敏感的肝癌組織相比，順鉑耐藥的肝細胞性肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)患者組織中，circRNA-101505與含氧化硝基結構域蛋白1(Oxidored-nitro domain-containing protein 1,NOR1)表達降低，而miR-103的表達升高，且circRNA-101505是作為miR-103的“海綿”發揮作用，在過表達circRNA-101505的肝癌細胞中發現，circRNA-101505/miR-103軸可增加NOR1的表達量，從而降低肝癌細胞對順鉑的耐藥性[56]。而在奧沙利鉑耐藥的HCC中，過表達的circFBXO11可減輕細胞周期阻滯和細胞凋亡，降低對奧沙利鉑的敏感性[57]。這些結果證實了環狀RNA在鉑類化療藥物耐藥中的重大意義，考慮到這些血清環狀RNA在監測耐藥性方面的敏感性和特異性，其有望成為抗癌耐藥最合適的候選分子。

2.4環狀RNA與索拉菲尼耐藥 索拉非尼通過酶抑制作用抑制癌細胞增殖和癌周血供，主要是通過靶向B-Raf原癌基因絲氨酸/蘇氨酸激酶(B-Raf proto-oncogene,serine/threonine kinase,BRAF)、C-Raf原癌基因絲蘇氨酸蛋白激酶(Recombinant C-Raf Proto Oncogene Serine/Threonine Protein Kinase,Raf-1)、跨膜配體Fms樣酪氨酸激酶3(FMS-like Tyrosine kinase 3,FLT3)、血管內皮生長因子-2/3(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2/3,VEGFR-2/3)和β型血小板衍生生長因子受體(Platelet-derived Growth Factor Receptor-β,PDGFR-β)等來發揮作用，特別是在調控細胞周期進程通路中發揮抗癌療效[58-60]。而索拉菲尼作為肝細胞癌標準靶向治療藥物之一，在全球晚期肝細胞性肝癌患者的治療中顯示其巨大作用，但其和絕大多數抗癌藥物一樣不可避免的出現耐藥反應。在對索拉非尼耐藥HCC細胞系中環狀RNA的表達譜進行分析，有582個環狀RNA差異性表達，其中272個上調，310個表達下調。通過高通量測序探索了索拉非尼耐藥HCC細胞系中差異表達的環狀RNA，鑒定出三個差異表達的環狀RNA，分別為hsa-circ-0006294、hsa-circ-0035944和hsa-circ-0084663，并預測它們在索拉菲尼化療耐藥中可能起重要作用[61]。

2.5環狀RNA與免疫治療耐藥 目前，抗PD-1作為癌癥臨床免疫治療的代表，顯示出其優越的應用前景[62]。PD1是一種抑制性受體，可在活化的淋巴細胞表面表達[63]。以肝細胞為例，PD1可以在肝癌患者的NK細胞上過度表達，并促進激活的NK細胞功能失調[64-65]。在肝癌細胞中，可通過上調circUHRF1的表達，使circUHRF1/miR-449c-5p軸不再抑制TIM-3的表達，從而抑制NK細胞發揮其功能。功能性實驗表明，將敲除circUHRF1的基因導入肝癌細胞后，抗PD1治療的敏感性可增加。這些結果表明，過表達circUHRF1可能會阻礙肝癌對抗PD1治療的反應，靶向circUHRF1可能是恢復肝癌對抗PD1治療敏感性的一種有效方法[66]。

2.6環狀RNA與內分泌治療 苯扎魯胺(Enzalutamide,Enz)是第二代內分泌治療藥物，它可以競爭性地與雄激素受體(Androgen Receptor,AR)結合，招募共激活劑，與AR DNA結合，激活AR靶基因[67]，但在治療后的2～3年內，大多數患者會發展成去勢抵抗型前列腺癌(Castration-resistant Prostate Cancer,CRPC)[68]。在苯扎魯胺耐藥(Enzalutamide-resistant,EnzR)的前列腺癌細胞中，檢測到circUCK2和10-11轉位酶1(Ten-eleven Translocation1,TET1)低表達，而miR-767-5p顯著表達。此外，上調circUCK2的表達水平，則miR-767-5p表達減少，靶基因TET1表達增加，并且出現癌細胞增殖和侵襲速度減慢。由此可推斷circUCK2在前列腺癌去勢、EnzR以及前列腺癌的發展過程中發揮重要作用[69]。在未來的臨床治療中，可通過檢測TET1的表達明確前列腺癌的進展，使用TET1激動劑或上調TET1的表達來輔助治療。他莫昔芬(Tamoxifen，TAM)是一種選擇性雌激素受體調節劑，廣泛用于乳腺癌的治療，然而接受TAM治療的患者中有30 %～40 %在15年內復發，成為典型的TAM耐藥腫瘤[70-71]。在構建的他莫昔芬耐藥乳腺癌細胞中，通過高通量測序技術檢測出，hsa-circ-0025202在癌組織中低表達，hsa-circ-0025202過表達可通過miR-1825P/FOXO3a軸實現抑瘤和他莫昔芬增敏作用[72]。hsa-circ-0025202可能是TAM耐藥的一個重要的、有前景的生物標志物，這需要進一步的臨床研究來證明。

綜上所述，耐藥已成為腫瘤治療中不可避免的一個問題，探索癌癥化療耐藥的機制將為改進腫瘤治療提供機會。已經證實，環狀RNA失調與腫瘤進展和化療耐藥密切相關。環狀RNA可在體液中大量表達，并可能以細胞和組織特異性的方式表達，它們還通過不同的生物學功能在腫瘤耐藥中發揮重要的作用。環狀RNA所特有的閉環結構為其在體液和血液中的穩定性存在提供了有利條件。液體活檢是一種微創的分析患者液體標本的方法，已廣泛應用于腫瘤檢測[73-74]。因此是否可將環狀RNA作為生物標志物納入臨床檢驗診斷，也是我們目前尚需考慮的一個方向。

3 前景及展望

越來越多的環狀RNA被證實與腫瘤藥物治療耐藥相關。因此，將環狀RNA納入臨床診斷治療，我們有兩方面需考慮。首先，其作為競爭性RNA分子，可調節miRNA的表達，能夠作為臨床治療的直接靶點[75]。一些主要致癌環狀RNA在不少腫瘤中的表達都存在異常，并與多藥耐藥相關。對這些致癌環狀RNA的精確調控可能會在惡性腫瘤的治療中起作用。環狀RNA特有的反向剪接結構代表了其可作為潛在的治療靶點，讓我們能夠更精確地調控這些致癌環狀RNA，且不會影響正常線性RNA的功能。其次，由于一些環狀RNA與miRNA結合位點數較多，其可作為腫瘤抑制因子成為潛在的治療靶點，circRNA-101505通過海綿化miR-103減輕肝癌對順鉑的耐藥性就是一個典型的例子[56]。事實上，環狀RNA的海綿作用可被用來特異性地設計和靶向致癌miRNA譜，從而發揮腫瘤治療作用。然而，實施上述任何一種策略，都將面臨一個主要挑戰，即如何準確、安全地將環狀RNA轉運到惡性腫瘤細胞中，并且不對正常細胞產生影響。制備環狀RNA模擬物或拮抗劑，并使其在體內保持穩定性、生物活性以及增加靶向遞送效率是成功開發基于環狀RNA療法的關鍵因素。