骨髓與脂肪間充質干細胞治療眼病的研究進展

于晨雨，梁榮斌，邵 毅

?KEYWORDS:mesenchymal stem cells; dry eye disease; retinopathy; cornea injury

0引言

針對不同眼疾的現代治療方法的開發和引入是醫學上的一大挑戰。近年來，眼科專家已經在干細胞研究上投入了大量的關注，因為成人體內任何組織的更新和再生都依賴于成體干細胞，眼組織也不例外[1]。干細胞具有很強的增殖能力，是一種可以分化為不同細胞類型的自我維持細胞群。成年人的干細胞分為造血干細胞、多能間充質干細胞和組織特異性祖細胞三大類別。其中，間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)有極強的自我更新和多向分化潛能，還具有低免疫原性和免疫調節性[2]，是最具有潛力的研究對象。MSCs除臍帶來源外，可根據組織來源分為骨髓間充質干細胞(bone marrow MSC，BMSCs)和脂肪間充質干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)。兩種MSCs都具有顯著的組織再生潛能——可以分泌信號分子。例如神經營養因子、生長因子和細胞因子，通過旁分泌作用發揮組織再生與損傷保護作用[3]。BMSCs可以分化為成骨細胞、軟骨細胞以及脂肪細胞[4]，且在向成骨細胞和脂肪細胞分化過程中維持動態平衡。近年來，臨床上大量引入BMSCs和ADSCs進行細胞水平的治療，其在眼病治療及臨床試驗上具有無限的價值與潛力。

1 MSCs的收集和給藥方法

1.1增加MSCs數量研究和尋找出可替代的且易獲得足夠數量的干細胞，對于干細胞治療，尤其是以細胞永久性喪失為特征的眼疾有重大的意義。BMSCs在骨髓中含量極低，僅有0.001%～0.01%，并且來源有限，需要進行有創方法才能獲取骨髓組織，無疑加重了患者的承受負擔。因此，有效提高BMSCs在生物工程中的利用率十分必要。脂肪是近年來研究較為熱門的干細胞來源，與骨髓相比，脂肪組織能夠通過較小創傷的方法分離并獲得數目更多的ADSCs[5]。

近年來，用于增加和收集MSCs的方法都有了顯著的進步。一項針對小鼠和人的研究表明，運動能增加造血干細胞(HSC)和極小的胚胎樣干細胞的動員[6]，同時，這與人們對急性心肌梗死、腦卒中以及其他疾病患者的觀察結果相似[7]。將干細胞動員的增加與干細胞的應用聯系起來，理解這些過程背后的級聯和機制并應用輔助療法，可能會為將來包括眼科在內的所有領域提供改善MSCs治療的方法。目前已經提出了改善MSCs治療的其他機制，包括使用常規的干細胞治療評估接近治療部位的輸送，并通過使用宿主細胞克服免疫排斥，從而克服傳統的移植并發癥[8]。

1.2 MSCs的給藥BMSCs與ADSCs的治療性給藥可通過多種方式應用于眼部，包括局部給藥、結膜下給藥、腹腔給藥和靜脈給藥。最近一篇關于小鼠角膜損傷后給藥的論文表明，相比于局部和腹腔給藥，結膜下和靜脈給藥在上皮完整性、加速組織修復、減少纖維化、角膜混濁和炎癥等方面顯示出更佳的治療效果[9]。因此，雖然角膜局部給藥更容易獲得，但與其他方法相比，它并不是療效最好的給藥方法。細胞的活力和功能會在受影響區域實現細胞保留然后提供細胞基質，還可能會影響療效。此外，大鼠的纖維蛋白膠內給藥、具有MSCs修飾的生物活性3D基質增加犬體內VEGF165和FGF2的產生等技術實驗，提供了提高療效的方法[10]。目前大多數在進行的均是動物臨床試驗，少有的人體臨床試驗還仍處于早期階段，因此，包括不良反應在內的全部臨床結果仍尚未確定。MSCs的部分作用可能與一些藥物治療存在著相似性：具有降低炎性因子腫瘤壞死因子-α含量的藥物；改善血管內皮細胞功能,逆轉高血糖、高血脂引起的內皮細胞功能損傷的藥物；抗血小板聚集類藥物；改善微循環類藥物等,MSCs的突出優點是能同時避免藥物性不良反應和副作用[11]。目前普遍認為，MSCs治療時要克服的主要障礙是供體異質性、體外擴增、免疫原性和冷凍保存幾個方面的問題[12]。

2 BMSCs與ADSCs對眼部疾病和損傷的治療

2.1治療干眼干眼(dry eye disease，DED)是眼科門診最常見的疾病，其主要特征是淚膜不穩定和高滲透的惡性循環所導致的眼表炎癥、損傷以及眼部異物感。中至重度的DED會伴有明顯的疼痛，導致患者生活質量下降，甚至產生抑郁等心理問題[13]。DED發病機制復雜，病因繁多，目前認為眼局部的炎癥免疫反應是引起干眼病理損害的重要機制，相應的抗炎治療是研究的熱點。

當炎癥在發病機制中起關鍵作用時，BMSCs可用于治療包括DED在內的許多眼表疾病。在眶內注射刀豆蛋白a的干眼綜合征小鼠模型中探究了BMSCs的治療潛力。實驗結果表明，眶周注射BMSCs可減少CD4+細胞浸潤，降低眼眶內腺體和眼表面炎性細胞因子水平。此外，BMSCs刺激了淚液的形成，顯著增加了結膜杯狀細胞的數量。該研究證實了注射BMSCs的角膜上皮細胞具有完整性。雖然沒有不良反應的報道，但是作者強調了BMSCs的一些免疫調節作用是有物種特異性的，也就是說，在不同物種中進行試驗是相當有必要的[14]。在蔡麗萍等[15]的實驗研究中發現，與小鼠模型組相比，BMSCs眼眶注射組可有效降低眼表炎癥指數、延長BUT、減少FLS、修復角膜上皮；同時，BMSCs眼眶注射組與陽性對照組、BMSCs滴眼組相比，結膜杯狀細胞數量及淚液分泌量明顯增多。因為炎癥微環境對干細胞的歸巢生存至關重要，不同的干眼造模方法，可能導致眼表微環境不同，這將影響BMSCs在眼表的存活、遷移以及增殖能力從而影響其在眼表的定植。所以具體關于BMSCs的應用方法和途徑還有待研究。

除此之外，在淚腺周圍植入同種異體ADSCs可顯著改善干眼的臨床癥狀，且在實驗期間效果穩定，對角膜沒有負面影響，也沒有退化或惡化的跡象。這些動物對細胞給藥耐受性也提示良好，在研究期間沒有任何全身或局部并發癥[16]。

2.2治療角膜疾病目前角膜病是引起視力喪失的第二位主要病因。角膜是一種保護性屏障，由具有不同起源的三層組織構成：上皮起源于淺表外胚層，基質和內皮起源于神經嵴細胞(間充質組織)。角膜上皮干細胞歷經干細胞、短暫擴增細胞(transient amplifying cells,TACs)和終末分化細胞(terminally differentiated cells,TDCs)3個分化階段而構成不斷更新的角膜上皮組織[17]。

臨床上通常將各種原因導致的眼表疾病的終末階段統稱為角膜緣干細胞功能障礙(limbal stem cell deficiency,LSCD)，會發生角膜上皮反復剝脫、角膜上皮結膜化、角膜新生血管、角膜混濁等臨床改變,嚴重威脅著患者的健康,最終導致視力喪失。LSCD的治療一直是臨床上的一大難題，近年來BMSCs羊膜移植手術的開展明顯提高了手術成功率。邵毅等[18]建立兔角膜緣干細胞缺損模型以探討無縫線BMSCs羊膜移植在兔角膜緣干細胞缺損模型的應用效果。隨機分為三組：實驗組(A組)行無縫線BMSCs羊膜移植術,陽性對照組(B組)行單純羊膜移植術，陰性對照組(C組)不做手術處理。A、B兩組兔術后28d,淚液分泌、角膜新生血管和角膜透明度組間比較差異均有統計學意義，角膜上皮數差異、炎癥細胞數差異也有統計學意義。實驗結果表明無縫線BMSCs羊膜移植術能有效預防兔角膜緣干細胞缺乏，且炎癥反應小,角膜透明度高。普遍認為LSCD的發病機制是角膜緣上皮基底層的干細胞缺失或受損所引起。但是，近年來有研究認為角膜上皮干細胞并非只存在于角膜緣部位，整個角膜上皮基底層均存在寡能干細胞(oligopotent stem cells,OSCs)，它們可能也是角膜上皮更新的重要細胞來源[19]，這為治療LSCD又提供了新的思路。將MSCs移植于角膜上皮基底層，使它們擁有可以獨立再生和維持上皮植片的能力，從而更新修復角膜上皮，重建角膜生理穩態。

同種異體ADSCs的結膜下植入可改善貓嗜酸性角膜炎的臨床表現。貓科動物的嗜酸性角膜炎是一種慢性角膜疾病，由免疫反應引起對未知抗原的刺激。在11mo的隨訪中，5只受移植貓沒有出現全身或局部并發癥，角膜和結膜狀態改善，無任何退行或惡化跡象[19]。在使用同種異體的ADSCs治療犬干燥性角膜結膜炎的研究中表明，在輕、中度病例中眼睛可恢復到健康狀態[20]。

2.3治療視網膜和視神經疾病近幾年有人提出MSCs治療可作為治療視網膜和視神經變性的有效方法。已經探知MSCs對視網膜神經節細胞具有保護作用，并通過分泌旁分泌因子刺激視神經軸突的再生。其作用機制大致如下：MSCs通過直接分泌神經營養因子，或刺激可在激活后提供額外旁分泌供應并能起細胞替代作用的內源性細胞，為視網膜受損細胞軸突神經的保護和再生提供營養供應[21]。有實驗研究表明ADSCs對視神經損傷后的纖維再生也有促進作用，有利于視神經軸突的再生、改善軸突運輸功能[22]。

MSCs給藥如今已成為治療糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)的方法之一。MSCs治療DR的可能機制有：向視網膜細胞分化、抑制視網膜新生血管形成、分泌神經營養因子、分化成胰島素分泌細胞以降低血糖、抑制炎癥反應及免疫調節作用等[23]。一項臨床初步試點研究顯示，在這種病理機制中，靜脈注射BMSCs是安全有效的[24]。在觀察視網膜下間隙移植自體BMSCs治療增生性糖尿病視網膜病變(PDR)的研究中，通過4例系列病例追蹤觀察，結果顯示，所有患者在成功接受移植手術后均未出現任何全身及眼部不適。表明視網膜下間隙移植自體BMSCs治療PDR是相對安全的,移植的干細胞發揮了局部抗炎的作用,未發現細胞的增生反應及循環改善效果[25]。在DR小鼠模型中研究，植入玻璃體腔的ADSCs在與視網膜血管聯系和維持時主要分化為周細胞，這表明ADSCs在DR治療中起到了獨特功效[26]。但是目前，應用MSCs治療DR的策略尚未被廣大患者接受，因為最佳給藥方式仍存在分歧，且其有效性及安全性仍需要更多的臨床應用進行進一步的評估。

年齡相關性黃斑變性(ARMD)是老年人群中最常見的致盲原因。ARMD分為干性ARMD和濕性ARMD 2種類型,目前臨床上對于ARMD的治療主要針對濕性ARMD伴發的脈絡膜新生血管(CNV),而對于干性ARMD尚無有效的治療方法。在ARMD的演變過程中,RPE細胞首先受到損害,進而使光感受器細胞(視錐、視桿細胞)等發生退行性改變[27]。洪玉等[28]研究表明,用含成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子及腦源性神經營養因子的條件培養基與RPE細胞培養液體外共培養后,BMSCs能夠誘導分化成光感受器樣細胞。在人體視網膜退行性病變的臨床模型中顯示，BMSCs對感光細胞具有保護作用。雖然BMSCs只要一注入視網膜下區域后就可以分化為感光蛋白表達細胞，但無法確定它們是否能分化為具有效能的視網膜細胞。其作用被認為主要與神經營養因子(NTF)釋放而引起的旁分泌效應有關，NTF可參與調節神經系統中神經元和其他細胞的生長、功能與存活。因此，目前認為BMSCs治療ARMD是通過分泌細胞因子(CK)和NTF而對受體細胞產生積極影響，并由免疫調節活性改變神經退行性變過程[29]。8例干型ARMD和黃斑營養不良的患者接受ADSCs植入治療第2階段結果顯示，所有患者沒有眼部或全身并發癥，且視力均得到了提高[30]。

2.4治療眼外傷眼堿燒傷是眼外傷中最嚴重的化學性損傷，由于各種手術本身均有一定的局限性，傳統的羊膜移植在臨床應用中受到一定的限制。目前，BMSCs移植治療眼表損傷模型已取得較好的效果，其療效優于傳統羊膜移植。在角膜化學性燒傷模型中，MSCs以旁分泌作用發揮其抗炎和抗血管生成的功效。研究表明將自體BMSCs在結膜下給角膜化學燒傷的大鼠注射，可促進角膜上皮再生、減少炎癥和新生血管，并增加抗炎細胞因子的表達[31]。在異體BMSCs給貓外傷性角膜潰瘍的結膜下注射的實驗中，也證明了類似的積極作用[32]。同時，與未進行細胞移植的對照組相比，對角膜化學燒傷的小鼠靜脈注射BMSCs也刺激了損傷部位的再生過程[33]。

有研究將分離培養并成功誘導的ADSCs貼附于羊膜上，再采用羊膜移植手術治療角膜堿燒傷后發現，角膜混濁程度及新生血管消退效果均明顯優于未誘導ADSCs+羊膜移植組及單純羊膜移植組。推測移植的ADSCs可分化為具有角膜上皮特征的細胞，重建眼表正常結構，同時也可減輕炎癥反應，抑制新生血管形成，并通過一些可溶性因子的分泌，調節局部免疫反應，改善眼表角膜上皮細胞生存的微環境，從而實現促進角膜修復的效果[34]。因此，誘導ADSCs+羊膜移植方法有望為嚴重眼表損傷的治療提供一種極具臨床應用前景的手段。

2.5其他BMSCs還可用于治療其他急慢性眼部疾病。例如，在嚙齒動物模型的前房注射BMSCs可以有效降低實驗性開角型青光眼的眼壓。有研究人員認為，這種深遠的影響是由于BMSCs的旁分泌因子。此外，BMSCs及其分泌的因子可誘導睫狀體中一個祖細胞池的活化，促進細胞增殖，在外傾角內可觀察到至少達1mo之久的增殖細胞[35]。

3展望

目前很多治療眼病(如DR、眼外傷等)的傳統方法有一定的自限性，在臨床應用中易受限，且難以徹底改善局部微環境，預后不佳。近幾年來,BMSCs和ADSCs已經在臨床上用于治療多種疾病,包括退行性病變、神經損傷、自身免疫性疾病、器官移植等,并已取得較為肯定的療效[36]。分離、培養和管理MSCs方法的多樣性促進了在細胞水平研究技術的發展，可由此根據病理學來治療多種眼部疾病。相對來說，BMSCs取材較困難且患者依從性差，而ADSCs作為成體干細胞的重要組成，不存在倫理學問題，易于獲取，且體外增生迅速，免疫原性低。近10a的研究表明，使用BMSCs和ADSCs治療某些眼部疾病是有科學證明且循證的，這將為常規臨床實踐提供快速有效的理論基礎。隨著研究技術的深入，需要不斷地提高關于BMSCs和ADSCs治療眼病的安全性和有效性，并確保技術的簡單性和可重復性。例如，通過移植自體BMSCs治療DR的安全性、倫理性已經得到基本肯定；在已進行的相關實驗模型中，雖然極少出現BMSCs和ADSCs移植的不良反應，但是它們的一些免疫調節作用是有物種特異性的[37]。因此，在不同物種中進行平行重復試驗是相當有必要的。

總的來說，大量科學研究已將BMSCs和ADSCs引入了眼科臨床實踐并不斷深化，為細胞水平的治療提供了巨大的機會，突出了MSCs在眼科學乃至整個生物學進化中的重要研究價值。在此基礎上，未來必然將探索出更多關于BMSCs和ADSCs更安全、高效的獲取途徑和給藥方法，其在細胞水平的臨床治療擁有無限的潛力和價值。