視神經脊髓炎相關性視神經炎實驗模型的建立及應用

韓夢雨，王志軍，金 明

?KEYWORDS:neuromyelitis optica; optic neuritis; animal experiment; cell experiment; experimental models

0引言

視神經脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是一種神經眼科交叉、高發于亞裔人群、體液免疫主導的中樞神經系統(central nervous system，CNS)星形膠質細胞病，以視神經炎(optic neuritis，ON)和急性橫貫性脊髓炎為典型臨床表現[1]。與NMO相關的特發性視神經炎稱為NMO相關性視神經炎(NMO-associated optic neuritis，NMO-ON)， NMO-ON患者很難從常規治療中獲益，多遺留不同程度的視神經萎縮[2-3]。抗水通道蛋白4抗體(aquaporin-4 immunoglobulin G，AQP4-IgG)的發現與確認使得NMO及NMO-ON在發病機制、診斷及治療上取得顯著的進步[4]。視神經在NMO中的特殊敏感性提示有必要研究視神經特異性NMO模型的發病機制和治療反應。然而，目前廣泛應用的NMO實驗模型是建立在已有的AQP4-IgG致病作用基礎上，只能部分模擬NMO病變。尤其是缺乏關注NMO-ON本身病理改變和發病機制的研究。本文將論述近年來關于NMO-ON及NMO實驗模型的研究進展，期望為NMO-ON發病機制的深入了解及開發新型診斷和治療方法提供幫助。

1動物實驗模型

1.1伴或不伴有炎癥介質的AQP4-IgG誘導的動物模型人和嚙齒動物AQP4蛋白結構相似，利用人AQP4-IgG建立了基于AQP4的NMO或NMO-ON嚙齒動物模型。但單一靜脈輸注或腹腔被動注射AQP4-IgG不足以產生NMO樣病變及臨床特征[5]，主要是因為AQP4-IgG無法通過完整的血-腦屏障(blood-brain barrier，BBB)進入CNS，故早期該類模型的建立多采用破壞或繞過BBB和在CNS產生抗原特異性T細胞的策略。如AQP4-IgG經完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)處理后，可破壞BBB，即可在部分大鼠體內產生NMO樣致病作用[6]。其它炎癥介質如趨化因子(如CXCL2)和促炎性細胞因子(如白細胞介素-6和干擾素-γ等)在紋狀體中的立體定向注射可誘導CNS炎性前狀態，促進AQP4-IgG進入注射半球并在注射部位附近誘發NMO樣病變。該模型為研究單個細胞因子或趨化因子在NMO和NMO-ON大鼠模型中損傷起始和演變中的作用提供了機會[6-7]。Sagan等[8]則論述了AQP4特異性T細胞誘導小鼠癱瘓及視覺系統損傷模型的詳細構建過程及其意義。

此外，以實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)為基礎，采用AQP4-IgG系統注射法構建了大鼠主動和被動NMO/EAE模型[7，9]，該模型原理為利用EAE破壞BBB并營造CNS炎性環境，隨后注射AQP4-IgG。不同點在于主動NMO/EAE模型將AQP4-IgG腹腔注射到預先用CFA乳化的牛髓鞘堿性蛋白免疫的大鼠[9]；被動NMO/EAE則將在體外抗原活化產生的反應性T細胞再輸注正常大鼠，接著腹腔注射AQP4-IgG[9]。如腹腔注射純化的人AQP4-IgG或桿狀病毒表達法產生的高親和力抗AQP4單克隆抗體(monoclonal antibodies，mAbs)，可導致EAE模型Lewis大鼠視交叉、脊髓和腦干出現嚴重的NMO-ON和NMO樣病變[10]。Jones等[11]則利用此類NMO大鼠模型證明了CXCR2抑制劑可阻斷EAE時中性粒細胞向脊髓的遷移，但對該模型的炎癥或AQP4損傷沒有明顯的減輕作用。受限于大鼠、AQP4-IgG需求量大、實驗結果易受EAE本身病理變化影響和脊髓內的病變呈現離散的小斑片狀等是NMO/EAE模型的缺陷。因此，與以往在EAE基礎上構建的模型不同，Yick等[12]使用細菌預處理的小鼠腹腔注射高劑量(4mg/d，8d，每只小鼠32mg/d)AQP4-IgG，也成功構造出AQP4-IgG誘發的補體無關的脊髓病變，包括星形細胞病變、神經炎癥、脫髓鞘和軸突損傷/丟失。Lee等[13]在小鼠L5～L6鞘內注射AQP4-IgG和補體，構建NMO/EAE小鼠新模型，模擬NMO患者臨床表現與病理改變之間的關聯性。

另一種NMO或NMO-ON動物模型的構造方式則是在大鼠鞘膜內或者腦內局部注射AQP4-IgG，不需要人補體及炎癥前狀態且避開BBB的屏障作用。如Lewis大鼠反復鞘膜內注射人AQP4-IgG，可建立緩解復發NMO病變的過程[14]。將純化的AQP4-IgG慢性注入大鼠腦脊液，也可導致脊髓和視神經出現NMO和NMO-ON樣病變[15]。但重復性及誘發率低、實驗者操作技術要求高、AQP4-IgG需求量更大等限制了使用大鼠構建此類模型。

1.2 AQP4-IgG和人補體共同誘導的動物模型與大鼠不同的是，AQP4-IgG并不能激活小鼠體內本身活性較低的補體系統，且小鼠血清對經典補體系統的激活具有天然較強的抑制作用[16]，故人類補體的注入是建立此類小鼠模型的必要條件。該類實驗模型使得無炎癥前狀態的AQP4-IgG介導的發病機制中補體激活的研究和臨床前治療方法的測試成為可能。在缺乏T細胞的裸鼠腦內注射AQP4-IgG和人的補體也能產生和野生型鼠相類似的NMO病灶，提示本模型不需要T細胞參與[17]。利用該類實驗模型證明了中性粒細胞[18]及抗體依賴性細胞毒性[19]在NMO或NMO-ON發病過程中的關鍵病理作用。Zhu等[20]利用腦內AQP4-IgG和人補體注射構建的小鼠NMO模型證明補體C5特異性單鏈抗體C5B3中和補體激活途徑中的C5，預防AQP4和星形膠質細胞的丟失，減少脫髓鞘、炎癥浸潤和膜攻擊復合物的形成。Zhang等[21]利用同類方法構建的NMO大鼠模型證明C16肽聯合血管生成素-1可通過改善炎癥環境來減輕NMO動物模型的進行性失明和癱瘓。

Matsumoto等[22]將AQP4-IgG陽性患者血清直接注射到SD大鼠的視神經鞘內，首次建立了NMO-ON模型。該類模型的病變局限于ON，排除其它病灶的干擾，為探討NMO-ON的作用機制和評價其潛在的治療作用提供了有價值的實驗模型。如CD59敲除鼠視神經病理改變明顯加重，提示補體調節因子在NMO-ON模型中的重要作用[16]。受此類研究方法影響，近期也有學者將AQP4-IgG陽性血清注入大鼠視神經蛛網膜下腔，構建一種視神經和視覺功能缺陷的NMO-ON模型，首次對活體NMO-ON動物模型的視覺功能和視神經變化進行縱向研究，創新性地用以探討視神經結構及視功能的進行性變化[23]。

1.3 AQP4-IgG陰性轉基因鼠模型的建立

1.3.1 TCR轉基因小鼠模型用AQP4胞外環免疫的致病性AQP4反應性T細胞建立小鼠AQP4-IgG血清陰性NMO模型。AQP4特異性T細胞分化為Th17表型，轉入野生型小鼠，即構建特異性T細胞受體(T cell receptor，TCR)轉基因小鼠模型，出現NMO樣表現，如尾肢無力，病理改變包括T細胞浸潤和在腦、脊髓和視神經的脫髓鞘。因此，即使在沒有AQP4-IgG的情況下，AQP4反應性T細胞在觸發小鼠NMO樣反應中也起著關鍵作用[24]。

1.3.2 MOG特異性BCR/TCR轉基因小鼠通過在C57BL/6基因背景下建立能在視神經內自發產生炎癥的轉基因小鼠，在理解ON的免疫發病機制方面取得了顯著進展。Bettelli等[25]首先構建少突膠質細胞糖蛋白(myelin oigodendrocyte glycoprotein-immunoglobulin G，MOG)特異性TCR轉基因鼠和特異性B細胞受體(B cell receptor，BCR)轉基因鼠雜交形成的雙轉基因的“2D2”小鼠模型，具備表達MOG35-55的TCR的T細胞大于98%、自發形成ON、模擬體內B細胞和T細胞免疫應答等特點，是目前研究NMO-ON免疫病理及視功能改變的熱點動物模型，該類模型能幫助認識出現NMO典型癥狀但AQP4-IgG血清陰性的NMO或NMO-ON患者致病性。該模型缺點是未發現血管周圍AQP4-IgG和補體成分的沉積、粒細胞浸潤等[24]，并且對于2D2小鼠視神經的優先靶向性還沒有令人滿意的答案。但該模型制備不受實驗室及操作者技術水平影響，模型成功率較高的優勢。因此，雙MOG轉基因小鼠盡管不能完全復制NMO病理學特征，但其有助于了解抗原特異性B細胞在調節自身反應性T細胞致病性方面的功能[25]。與MOG特異性BCR和TCR雙轉基因小鼠相似，用AQP4特異性BCR和TCR轉基因小鼠建立AQP4-IgG陰性免疫鼠模型有助于闡明免疫介導的脫髓鞘發生機制。但只有60%的實驗動物表現出NMO樣病理特征，包括大腦、視神經和脊髓的T細胞浸潤和脫髓鞘[24，26]。總之，在轉基因小鼠模型中檢測和操作視神經的炎性脫髓鞘是神經眼科免疫學研究的一個非常有價值的資源。

2離體組織實驗模型

用含有NMO患者AQP4-IgG的血清或純化的AQP4-IgG等處理體外培養的鼠脊髓、視神經或海馬切片，可構建NMO的離體組織或器官模型，用于NMO或NMO-ON的病理機制研究或治療藥物篩選。第一個離體NMO器官模型是由Verkman的小組構建的[27]，在該模型中，橫斷脊髓切片在多孔的跨孔支架上培養數天，當切片暴露于帶有補體的AQP4-IgG中1～3d時，會發生NMO樣病變。這類模型的主要局限性在于不能提供有關該疾病全身效應的信息及不能評估BBB在NMO發病中的作用。然而，其具有NMO和NMO-ON的其他病理特征[6]，如視神經或視網膜培養物暴露于AQP4-IgG和補體可導致視神經和視網膜中AQP4和GFAP的表達顯著減少[28-30]，這種病理過程可明顯地被溶酶體酸化或內吞抑制劑阻止。因此，AQP4-IgG被動轉移誘導的視神經和視網膜病理改變是不依賴于補體的[29]。Tradtrantip等[31]則利用NMO脊髓切片模型證明重組IgG1-Fc六聚體對NMO病理形成過程中的預防作用。

3細胞實驗模型

細胞實驗模型主要用于研究基于AQP4-IgG介導的星形膠質細胞病變，可用于篩選維持星形膠質細胞存活、阻斷AQP4-IgG介導的星形膠質細胞表型改變和細胞死亡的藥物作用。構建方式包括從不同組織直接獲取星形膠質細胞培養或用質粒轉染構建能穩定表達不同AQP4的細胞模型。Kinoshita等[32]首次證明，NMO患者血清中AQP4-IgG通過經典的補體依賴途徑誘導大鼠星形膠質細胞壞死，為模擬在NMO發展過程中自身抗體介導的星形膠質細胞的丟失提供了細胞模型。Sun等[33]開發了一種穩定表達人M23-AQP4的中國倉鼠肺成纖維V79細胞的NMO治療藥物的高通量篩選模型，用于鑒定AQP4-IgG和AQP4結合的小分子抑制劑，并提出中藥成分異粉防己堿通過阻斷AQP4-IgG與AQP4的結合降低NMO星形膠質細胞的細胞毒性。Hinson等[34]報道AQP4及其連接的谷氨酸轉運體-2的內化需要AQP4-IgG與AQP4和星形膠質細胞Fcγ受體結合，該實驗結果為開發治療NMO或NMO-ON的新藥物提供了上游靶點證據。近年來也開發出抑制補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)的細胞模型[31]。由于AQP4-IgG能識別NMO中AQP4的胞外結構域(extracellular domains，ECDs)，因此用抗AQP4的mAbs也建立了小鼠NMO細胞模型。桿狀病毒表達法可產生兩個抗AQP4-mAbs，稱為E5415A(識別M1和M23 AQP4亞型)和E5415B(僅識別M23亞型)。E5415A通過增強星形膠質細胞表面AQP4簇形成所觸發的M1和M23的內吞作用誘導表達AQP4的星形膠質細胞降解，而E5415B的損傷明顯減輕。這項研究表明，抗AQP4-ECD抗體能夠交聯多個AQP4陣列，形成一個AQP4大簇，導致AQP4內吞和溶酶體降解[35]。

4結語

本文從細胞、離體組織及動物等不同層面論述了NMO及NMO-ON的實驗模型的建立及應用，相關實驗模型的構建已為NMO-ON和NMO相關的發病機制、開發有效治療等方面做出重大貢獻。但復雜的病理學和視覺系統的特殊性導致了難治性NMO-ON及其實驗模型的構建。因此，在NMO實驗模型基礎上開發更特異性、能直接評價活體動物的視功能和視神經形態的NMO-ON實驗模型需要進一步的研究。期望本文能為未來NMO和NMO-ON的發病機制、診斷及治療等研究提供幫助。