間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性呼吸窘迫綜合征的機(jī)制研究進(jìn)展

陳鏡伊，梁志欣

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100853

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是指各種致病因素導(dǎo)致肺部甚至全身過度的炎癥反應(yīng)激活，表現(xiàn)為肺上皮和血管內(nèi)皮破壞，肺泡清除率下降，從而發(fā)生非心源性肺水腫[1]，是多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的重要組成部分，根據(jù)低氧血癥程度(PaO2/FiO2)可將其分為輕、中、重度。病理研究發(fā)現(xiàn)，ARDS不僅可以表現(xiàn)為彌漫性肺泡損傷，還可能存在嗜酸性肺炎、急性纖維化、彌漫性肺泡出血等多種組織病理學(xué)改變[2]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)最早由Friedenstein等[3]在骨髓中發(fā)現(xiàn)。MSCs作為一種異質(zhì)細(xì)胞，早在2006年國際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)(ISCT)給予了其定義的最低標(biāo)準(zhǔn)：1)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，MSCs必須保持塑料黏合性；2)MSC必須表達(dá)CD105、CD73和CD90，不表達(dá)CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19、HLA-DR；3)MSCs必須在體外可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。目前，可從骨髓、臍帶血、脂肪等分離和制備間充質(zhì)干細(xì)胞，以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells，BMSCs)應(yīng)用最為廣泛。間充質(zhì)干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖能力、多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)功能，還具有來源方便、不存在免疫排斥等特征，且與胚胎干細(xì)胞相比，無道德倫理問題。可應(yīng)用于造血干細(xì)胞移植、組織損傷修復(fù)、自身免疫疾病治療以及充當(dāng)基因治療載體等。ARDS常見病因?yàn)閿⊙Y、肺炎和外傷等，可發(fā)展至多器官或組織的損傷。目前治療方法主要為保護(hù)性機(jī)械通氣，急性期內(nèi)尚缺乏有效治療措施，死亡率約40%，且隨年齡增大死亡率有增加的趨勢[4]。MSCs治療ARDS的臨床試驗(yàn)始于2014年，較早發(fā)布研究成果的有Wilson、Zheng等[5-6]團(tuán)隊(duì)，隨后陸續(xù)開展MSCs用于治療中度至重度ARDS的臨床研究，目前已有Ⅰ期和Ⅱa期臨床試驗(yàn)的相關(guān)報(bào)道[5,7]。為闡明MSCs治療ARDS的可能機(jī)制，現(xiàn)就MSCs的歸巢分化、分泌功能、炎性因子調(diào)節(jié)、巨噬細(xì)胞極化和基因修飾五個(gè)層面進(jìn)行綜述。

1 歸巢與分化

MSCs的歸巢特性是其治療ARDS的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。據(jù)相關(guān)研究，MSCs具有向受損部位遷移的特性，而正常組織并不會(huì)引發(fā)MSCs的聚集效應(yīng)。外源性MSCs歸巢至損傷肺組織可歸納為以下5個(gè)步驟：1)初始識別和滾動(dòng)：MSCs借助其表面抗原CD44可緊貼內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的選擇素，實(shí)現(xiàn)在血管壁上的滾動(dòng)；2)活化：炎癥信號引起趨化。此過程中，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1作為趨化因子受體CXCR4的配體，對MSCs歸巢至損傷肺組織具有至關(guān)重要的作用；3)捕捉：MSCs經(jīng)趨化因子活化后，表面VLA-4整聯(lián)蛋白與血管內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM-1相互結(jié)合；4)穿出：指MSCs像紅細(xì)胞一樣穿過內(nèi)皮細(xì)胞和基底層，離開血液循環(huán)；5)遷移：經(jīng)間質(zhì)抵達(dá)受損肺組織[8]。

研究表明，BMSCs歸巢后可分化為Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，對損傷的肺泡-毛細(xì)血管屏障進(jìn)行修復(fù)，從而減輕滲出，改善肺水腫。ARDS狀態(tài)下，過量的中性粒細(xì)胞遷移導(dǎo)致肺上皮受損。Jiang等[9]將BMSCs與Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(alveolar typeⅡepithelial cell，ATⅡ)共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)BMSCs主要分化為ATⅡ細(xì)胞。此外，MSCs還可分泌多種生長因子，如角質(zhì)細(xì)胞生長因子(keratinocyte growth factor，KGF)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)等。Zhu等[10]通過離體灌注人肺中建立的大腸埃希菌肺炎模型發(fā)現(xiàn)，MSCs促進(jìn)單核細(xì)胞分泌KGF可能介導(dǎo)了肺泡液清除功能的恢復(fù)并促進(jìn)肺上皮修復(fù)。體外研究發(fā)現(xiàn)，MSCs可通過分泌HGF來改善跨單層人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白質(zhì)的通透性，并修復(fù)肺內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接和黏附連接[11]。Hu等[12]的研究構(gòu)建了HGF基因敲除的MSCs，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MSCs需要通過HGF的表達(dá)來恢復(fù)肺血管通透性，上調(diào)VE-鈣黏著蛋白表達(dá)，保護(hù)肺內(nèi)皮細(xì)胞免于凋亡。

此外，MSCs可向受損傷的肺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移細(xì)胞質(zhì)成分和線粒體以參與上皮修復(fù)。Sinclair等[13]將BEAS2B上皮細(xì)胞與標(biāo)記的MSCs共培養(yǎng)，用分子抑制劑來確定隧道納米管等結(jié)構(gòu)的作用，發(fā)現(xiàn)從支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)分離的MSCs(BAL-MSCs)和人類肺組織分離的MSCs(LT-MSC)向BEAS2B上皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)和線粒體的轉(zhuǎn)移，通過接觸依賴性機(jī)制和非接觸性依賴機(jī)制介導(dǎo)，且BAL-MSC和LTMSC的單向細(xì)胞質(zhì)和線粒的轉(zhuǎn)移效率相似。

2 自分泌與旁分泌

MSCs具有自分泌和旁分泌功能，可分泌多種生長因子和細(xì)胞因子參與歸巢分化和免疫調(diào)控等過程。目前發(fā)現(xiàn)的MSCs分泌的可溶性因子有KGF、血管緊張素Ⅰ(angiotensin Ⅰ，Ang Ⅰ)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL-1)受體拮抗劑、IL-10、前列腺素E2(prostaglandin E2，PEG2)、抗菌肽LL-37等。MSCs的旁分泌效應(yīng)主要依靠細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)來實(shí)現(xiàn)。EV可源于人體的各種細(xì)胞，包括微泡(microvesicle，MV)、外泌體和凋亡小體。EV可分泌多種生物活性物質(zhì)，并參與細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)，如蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA以及線粒體，主要功能為細(xì)胞間信息交流。MSCs來源微泡的LC-MS/MS分析已鑒定出730種蛋白，其對組織的修復(fù)再生潛力尚需深入研究。Lu等[14]在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷(acute lung injury，ALI)模型中發(fā)現(xiàn)，MSCs通過旁分泌HGF激活HGF/Akt途徑，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分化為耐受性樹突狀細(xì)胞，減輕肺水腫(肺濕重/干重比降低)，研究還發(fā)現(xiàn)該分化具有HGF依賴性，HGF基因高表達(dá)時(shí)效果較好，反之則較差。

鑒于MSCs的致瘤風(fēng)險(xiǎn)，現(xiàn)階段認(rèn)為干細(xì)胞源性條件培養(yǎng)基(conditioned medium，CM)和MSCs來源的EV是更理想的干細(xì)胞治療替代品[15]。EV優(yōu)點(diǎn)在于低致瘤性，低免疫原性。對MSCEV進(jìn)行預(yù)處理可優(yōu)化療效，同時(shí)應(yīng)選擇合適的EV生長階段[16-18]。同樣的，MSC-EV對COVID-19的治療效果也十分吸引人。外泌體(ExoFlo)是EV的重要來源之一，Sengupta等[19]已進(jìn)行了BMSCs來源外泌體應(yīng)用于COVID-19患者治療的前瞻性非隨機(jī)隊(duì)列研究，不僅證實(shí)了其安全性和有效性，還發(fā)現(xiàn)ExoFlo很可能降低氣管插管和機(jī)械通氣的使用，有待進(jìn)行完全隨機(jī)對照試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)其療效。

此外，MSCs分泌的抗菌肽、KGF等相關(guān)物質(zhì)及其促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用，可實(shí)現(xiàn)對病菌的清除。感染作為ARDS常見的始動(dòng)因素，及時(shí)清除病菌在其治療中顯得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽hCAP-18/LL-37是MSCs發(fā)揮其抗菌作用的因素之一，KGF可通過AKT磷酸化來減少單核細(xì)胞凋亡，從而提高細(xì)菌清除率。此外，Jackson等[20]的研究在大腸埃希菌誘導(dǎo)的小鼠肺炎模型中發(fā)現(xiàn)，MSCs可通過隧道納米管將線粒體轉(zhuǎn)移至肺泡巨噬細(xì)胞，從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力。

3 炎性因子調(diào)節(jié)

炎性因子風(fēng)暴在ALI/AR DS的進(jìn)展中起著重要的作用。ARDS有兩種亞型：高炎癥亞型和低炎癥亞型[21]。與低炎癥亞型相比，高炎癥亞型的ARDS特點(diǎn)在于血漿炎癥標(biāo)志物明顯升高、升壓藥使用率高、敗血癥發(fā)生率高和血清碳酸氫鹽濃度低[22]。研究發(fā)現(xiàn)MSCs可降低促炎因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、γ干擾 素(interferon-γ，IFN-γ)、IL-1α、IL-1β、IL-6等，同時(shí)提高抗炎因子水平，如IL-4、IL-5、IL-10等。特別的是，在不同的研究中發(fā)現(xiàn)MSCs對某些因子的分泌水平的調(diào)節(jié)并不一致[23]。Cóndor等[24]發(fā)現(xiàn)MSCs可提高IL-10水平，而Sepúlveda等[25]發(fā)現(xiàn)MSCs有降低IL-10的作用。這種不一致性在其對IFN-γ的調(diào)節(jié)上亦有體現(xiàn)，MSCs既可增加IFN-γ分泌，又可減少IFN-γ分泌[26]。還有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSCs對IFN-γ水平并無明顯影響。

Walter等[27]及其團(tuán)隊(duì)已證實(shí)BMSCs的亞群可分泌IL-1Ra、腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白6(tumor necrosis factor alpha stimulated gene-6，TSG-6)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)，IL-1Ra可以抑制輔助T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α；在LPS誘導(dǎo)的ALI模型中，BALF中可見高表達(dá)的TSG-6，細(xì)胞因子和炎癥細(xì)胞水平較低，并且敲除人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)中的TSG-6 mRNA可降低(hMSCs的抗炎作用。IGF-1可使肺泡巨噬細(xì)胞向M2抗炎表型分化。此外，PGE2是一種強(qiáng)效的免疫調(diào)節(jié)因子。有研究表明，當(dāng)血液中PGE2濃度升高時(shí)，肺中的巨噬細(xì)胞向M2極化增多。

4 巨噬細(xì)胞極化

肺泡巨噬細(xì)胞是呼吸道的第一道免疫防線，在炎癥發(fā)展過程中具有不可忽視的作用。巨噬細(xì)胞的極化分為M1型和M2型兩種。M1型為促炎型，主要在急性炎癥期極化，此時(shí)高表達(dá)一氧化氮合酶和CD86，可以由LPS和IFN-1誘導(dǎo)，能產(chǎn)生促炎因子如TNF-α、IL-1β等。M2型為抗炎高吞噬型，CD206是其表面標(biāo)志物，可以由IL-4誘導(dǎo)。與MSCs共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞CD206表達(dá)增加，該條件下的巨噬細(xì)胞具有以下典型特征：表達(dá)高水平IL-10和低水平IL-12。此外還表達(dá)IL-6和TNF-α，并且呈現(xiàn)出高吞噬性。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在ARDS中，MSCs通過EV介導(dǎo)的線粒體轉(zhuǎn)移也可使肺泡巨噬細(xì)胞向M2型分化。MSCs主要通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的氧化磷酸化誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，抑制炎性因子分泌，在肺組織的損傷和修復(fù)中具有重要作用[28]。

除巨噬細(xì)胞外，中性粒細(xì)胞也是ALI/ARDS的主要效應(yīng)細(xì)胞之一。免疫反應(yīng)中，中性粒細(xì)胞除了具有吞噬和分泌功能外，還會(huì)形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)，更有效地捕獲病原體。然而NETs的過度增加會(huì)引起組織損傷，如在ARDS中，NETs可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，放大炎癥反應(yīng)[29]。Pedrazza等[30]研究發(fā)現(xiàn)MSCs在LPS誘導(dǎo)的ALI動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭胁粌H具有抗炎、抗組織損傷等作用，還可減少NETs的形成，有效提高了存活率。

5 基因修飾

向MSCs中導(dǎo)入外源基因并整合，最有效的方法是病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，以慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)較為多見，非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)因技術(shù)不成熟等缺陷而受限。基因修飾旨在改善MSCs歸巢和抗凋亡、更有效地控制炎癥、修復(fù)上皮，從而減輕肺水腫。如血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)具有抗炎，抗氧化和抗凋亡等作用。Chen等[31]經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)建立的MSC-HO-1對LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型具有更好的治療效果，研究發(fā)現(xiàn)MSC-HO-1在體外實(shí)驗(yàn)中具有抗凋亡、增強(qiáng)MSCs的旁分泌和減輕肺水腫的特性。

MSCs的歸巢能力是肯定的，不足在于MSCs歸巢范圍并不十分精準(zhǔn)，低歸巢率使其療效大打折扣。進(jìn)行基因修飾后的MSCs歸巢能力得到很大程度改善，且已成為研究熱點(diǎn)。Yang等[32]發(fā)現(xiàn)趨化因子受體CXCR4具有改善MSCs歸巢和旁分泌的作用，故過表達(dá)CXCR4的MSCs對ARDS的治療潛力有所提高。Meng等[33]敲除MSCs的LincRNA-p21和缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)抑制劑KC7F2后評估MSCs的遷移、增殖、凋亡及HIF-1α和CXCR4/7蛋白，發(fā)現(xiàn)低氧預(yù)處理可增加LincRNA-p21和HIF-1α表達(dá)，并通過激活CXCR4/7途徑改善MSCs遷移和存活，但該研究的局限在于24 h內(nèi)的體外研究。

炎癥的控制對于ALI/ARDS的治療及預(yù)后尤為重要，增強(qiáng)MSCs的抗炎作用將增益MSCs的治療效果。IL-33/IL-1受體樣1(ST2)軸在肺部免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。基因修飾后的高表達(dá)sST2的人脂肪來源干細(xì)胞能更好地控制ALI/ARDS的炎癥反應(yīng)。MSCs分泌的KGF是最強(qiáng)大的細(xì)胞因子之一，通過促進(jìn)Ⅱ型肺泡細(xì)胞增殖和刺激表面活性劑合成參與水腫清除和肺上皮愈合過程。在LPS誘導(dǎo)的ALI鼠模型中，通過量化BALF中的總蛋白可發(fā)現(xiàn)過表達(dá)KGF的MSCs使肺水腫明顯減少。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)過表達(dá)的MSC-ACE2用于LPS誘導(dǎo)的ALI可保護(hù)內(nèi)皮，減輕炎癥和病理損傷[34]。Hippo信號下調(diào)可促使mMSCs分化為Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，從而修復(fù)受損組織，改善肺上皮的通透性和肺水腫，此外Li等[35]在LPS誘導(dǎo)的ARDS動(dòng)物模型中，通過Last1基因敲除，下調(diào)Hippo信號通路可減輕炎癥、改善病理損傷和纖維化。但由于ARDS在遺傳學(xué)無明顯異質(zhì)性等問題，仍需進(jìn)一步研究。新的研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)p130或E2F4的mMSCs向肺上皮細(xì)胞分化增多，從而修復(fù)ARDS肺部組織的損傷并恢復(fù)功能[36]。

6 結(jié)語

MSCs憑借其組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)等獨(dú)特的生物學(xué)特性，為ALI/ARD的治療開辟了新的思路。如在COVID-19的治療中，臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)被認(rèn)為是最為理想的干細(xì)胞類型[37]，且UC-MSCs用于治療COVID-19已通過Ⅰ期臨床試驗(yàn)，對于中重度患者的早期治療，靜脈輸注UC-MSCs安全性和耐受性良好，但重癥患者的長期預(yù)后有待Ⅱ、Ⅲ期隨機(jī)安慰劑對照療效試驗(yàn)完善[38]。MSCs用于COVID-19的治療雖尚處于臨床試驗(yàn)階段，但其用于治療ARDS已成為新策略并納入了臨床應(yīng)用。然而MSCs的安全性和有效性并不完全肯定，近年來不少研究已把重點(diǎn)放在改善其歸巢率、成活率等亟須解決的問題上[39]。再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用于ARDS的治療有著廣闊的前景。