基于自噬探討肝纖維化發(fā)病機(jī)制以及壯肝逐瘀煎的潛在干預(yù)作用▲

梁仁久 梁 堯 李建明 黃貴華

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧市 530200，電子郵箱：1060739511@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧市 530022)

【提要】 肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的共同病理過程，其發(fā)病率和病死率較高，但治療手段有限。近年來中醫(yī)中藥給肝纖維化的治療提供了新思路。自噬是一種可降解受損細(xì)胞器或蛋白質(zhì)的細(xì)胞過程，其參與了肝纖維化的發(fā)展過程。為此，本研究基于自噬對肝纖維化發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了總結(jié)，并針對肝纖維化有效方藥壯肝逐瘀煎進(jìn)行分析，以期為臨床了解自噬與肝纖維化的關(guān)系，以及壯肝逐瘀煎通過調(diào)控自噬防治肝纖維化的潛力提供參考。

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的共同病理過程，其主要病理改變?yōu)榧?xì)胞外基質(zhì)過度沉積，降解相對不足。肝星狀細(xì)胞是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源，該細(xì)胞的活化是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。自噬是一種分解代謝的細(xì)胞內(nèi)途徑，其將有缺陷或過量的細(xì)胞器靶向降解為氨基酸、游離脂肪酸或其他的小分子。肝星狀細(xì)胞的自噬理論已經(jīng)成為目前肝纖維化研究的熱點。中醫(yī)藥治療肝纖維化的機(jī)制主要是抑制肝臟炎癥、抑制肝星狀細(xì)胞增殖、拮抗細(xì)胞因子、促進(jìn)凋亡等[1]，但從自噬角度探討中藥療效的研究甚少。為此，本文基于自噬探討肝纖維化發(fā)病機(jī)制，同時探討壯肝逐瘀煎[2-3]治療肝纖維化的可能機(jī)制。

1 肝纖維化的研究概況

肝纖維化是各種病因引起的慢性肝病的愈合反應(yīng)，其促使慢性肝病向晚期肝硬化甚至肝癌發(fā)展，目前缺乏有效的療法。持續(xù)的實質(zhì)細(xì)胞損傷導(dǎo)致肝內(nèi)免疫細(xì)胞的募集以及致纖維化細(xì)胞的活化和積累。致肝纖維化細(xì)胞主要為肝星狀細(xì)胞，其失去脂質(zhì)滴(由維生素A組成的細(xì)胞質(zhì))后轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞[4]，后者為了限制肝損傷合成并分泌細(xì)胞外基質(zhì)[5]。此外，肝星狀細(xì)胞還產(chǎn)生降解細(xì)胞外基質(zhì)的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)，以及特定的金屬蛋白酶抑制劑來抑制MMP的活化[6]。簡而言之，肝細(xì)胞損傷、免疫細(xì)胞募集和致纖維化細(xì)胞活化引起細(xì)胞外基質(zhì)積累和降解失衡，最終導(dǎo)致肝纖維化。肝纖維在發(fā)生后的1～10年可發(fā)展為肝硬化，而肝硬化后7～10年的肝臟相關(guān)病死率達(dá)12%～25%[7]，但目前仍缺乏有效的臨床療法。

肝纖維化的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，尚未完全明確，其中自噬是肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的重要病理生理學(xué)機(jī)制之一，在肝纖維化形成過程中具有重要的作用。因此，以自噬理論為研究基礎(chǔ)，探索肝纖維化的防治措施成為當(dāng)前的研究熱點。

2 自噬與肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系

自噬作為一種分解代謝的細(xì)胞內(nèi)途徑，根據(jù)底物如何遞送至溶酶體進(jìn)行降解，分為3種類型，即大自噬、微自噬和伴侶介導(dǎo)的自噬，其中大自噬是主要類型。盡管自噬被認(rèn)為是一種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，但過度自噬會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，即Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡[8]。有學(xué)者研究肝星狀細(xì)胞在肝纖維化過程中的作用機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，肝星狀細(xì)胞通過接受自分泌或旁分泌信號轉(zhuǎn)為高度活化、增殖、運動和收縮的成纖維細(xì)胞表型[9]，其限制了肝細(xì)胞損傷同時又導(dǎo)致了肝纖維化，這一過程與自噬理論頗為相似。自噬是一把雙刃劍[10]，目前研究尚未明確自噬是否開啟了細(xì)胞的程序性死亡或直接導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，這需要更多的研究進(jìn)行驗證探索。

2.1 自噬與肝纖維化病理生理的關(guān)系 越來越多的證據(jù)支持自噬參與了許多人類疾病的病理生理過程，其中就包括肝纖維化。自噬損傷可通過減少缺陷細(xì)胞器和降解未折疊的蛋白，從而導(dǎo)致脂質(zhì)氧化、過氧化物酶體自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬。自噬能減輕肝細(xì)胞損傷，降低代謝水平從而減輕肝纖維化[11-14]。自噬的增加，減少了急性乙醇誘導(dǎo)的小鼠肝毒性和脂肪變性，同時血清炎癥標(biāo)志物和肝組織三酰甘油水平明顯降低[15]。自噬可降解活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶[16]，從而減輕肝臟損傷，發(fā)揮抗纖維化作用。此外，α-1抗胰蛋白酶作為一種自噬增強(qiáng)藥物，被證明可以減輕肝臟負(fù)荷并逆轉(zhuǎn)纖維化[17]。總之，上述研究表明增強(qiáng)自噬可抑制肝纖維化。

2.2 自噬與肝星狀細(xì)胞激活的關(guān)系 肝星狀細(xì)胞中的磷脂酶D1可誘導(dǎo)自噬并抑制Ⅰ型膠原的積累[18]。另一方面，在肝星狀細(xì)胞激活過程中自噬的程度增加，但這一現(xiàn)象可被自噬抑制劑巴佛洛霉素A1抑制[19]。此外，肝星狀細(xì)胞的激活可被3-甲基腺嘌呤或氯喹阻斷，這表明自噬和肝星狀細(xì)胞的激活呈正相關(guān)，所以要達(dá)到抑制肝星狀細(xì)胞激活的目的，可以通過中斷肝星狀細(xì)胞活化的各個階段的自噬來實現(xiàn)[20]。Hernández-Gea等[21]的研究已表明，自噬通過激活小鼠和人體組織中的肝星狀細(xì)胞釋放脂質(zhì)，從而促進(jìn)纖維發(fā)生。還有研究表明通過藥理拮抗作用來抑制自噬進(jìn)程，或者抑制自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene 5，Atg)5、Atg7的表達(dá)，也會導(dǎo)致纖維發(fā)生減弱[22]。同樣，用四氯化碳或硫代乙酰胺干預(yù)后的小鼠，肝星狀細(xì)胞Atg7基因的特異性缺失，這一過程保留了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)液滴，從而顯著減少組織纖維化[23]。這些結(jié)果表明自噬通過降解細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)小滴從而誘導(dǎo)組織纖維發(fā)生，這被稱為脂質(zhì)吞噬。

2.3 從自噬角度抗肝纖維化 眾所周知，肝星狀細(xì)胞在激活過程中會失去由維生素A組成的細(xì)胞質(zhì)脂質(zhì)小滴，從而從靜止細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為活化的成纖維細(xì)胞。自噬增加可激活肝星狀細(xì)胞和肝纖維化的進(jìn)展。研究表明[24]，氧化應(yīng)激介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有助于肝星狀細(xì)胞中未折疊蛋白反應(yīng)的活化，從而導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞活化。這些證據(jù)強(qiáng)烈表明自噬與肝星狀細(xì)胞激活有關(guān)。因此，阻斷自噬是控制或預(yù)防纖維化進(jìn)展的治療策略之一。

目前，已經(jīng)有多種方法能抑制肝星狀細(xì)胞中的自噬。尼羅替尼是一種酪氨酸激酶抑制劑，已被證明可通過抑制組蛋白脫乙酰基酶誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及肝星狀細(xì)胞的自噬，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[25]。這意味著自噬的過程被抑制不僅降低了肝星狀細(xì)胞的活化，還誘導(dǎo)了肝星狀細(xì)胞的凋亡。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，α-酮戊二酸二甲酯可通過抑制肝星狀細(xì)胞的自噬減少四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化[26]。此外，使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤治療肝纖維化會引起肝組織α-平滑肌動蛋白和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，并導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯(G2期)，從而抑制肝星狀細(xì)胞的體外增殖和活化[27]。因此，進(jìn)行深入研究來闡明自噬抑制肝纖維化進(jìn)展的具體機(jī)制具有一定意義。

轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1是肝纖維化的經(jīng)典信號傳導(dǎo)途徑，其可誘導(dǎo)自噬[28]，提示自噬可能通過TGF-β途徑參與纖維化。此外，TGF-β可能通過TGF-β活化激酶(TGF-β activated kinase，TAK)1-絲裂原活化蛋白激酶3-p38和TAK1-AMP活化蛋白激酶途徑刺激自噬，導(dǎo)致纖維化反應(yīng)[29]。還有研究表明在治療肝纖維化過程中肝星狀細(xì)胞的凋亡有助于減少活化的肝星狀細(xì)胞的數(shù)量[30]。而MMP1和TGF-β的組織抑制劑也可作為抗凋亡信號，并促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的存活[31]。

3 中醫(yī)角度下肝纖維化與自噬的關(guān)系及壯肝逐瘀法的潛在干預(yù)作用

中醫(yī)理論認(rèn)為，“氣是人體內(nèi)活力很強(qiáng)、運行不息的極精微物質(zhì)，是構(gòu)成人體和維持人體生命活動的基本物質(zhì)”，氣的功能可以調(diào)節(jié)機(jī)體的“太過”和“不足”，以期達(dá)到機(jī)體的陰陽平衡[32]。自噬就如同中醫(yī)中的陰陽，是機(jī)體對正虛邪實的一種自我調(diào)節(jié)方式[33]。在中醫(yī)理論體系中肝纖維化并無確定的病名，但其病理產(chǎn)物的累積與中醫(yī)濕、熱、毒、濁的蓄積類似。

肝纖維化常為肝內(nèi)陰血虧虛、瘀血阻滯、痰結(jié)濕聚、血熱毒聚等日久糾結(jié)而成，是機(jī)體氣血陰陽狀態(tài)失衡的表現(xiàn)。細(xì)胞自噬是一種“自我消化”的過程，在一定條件下自噬被啟動以維持基本的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。因此，中醫(yī)藥常用滋補(bǔ)肝陰、化痰祛瘀、補(bǔ)氣健脾、清熱解毒等方法，通過啟動自噬影響肝纖維化。《內(nèi)經(jīng)》認(rèn)為肝為“剛臟”，肝臟較為特殊，在生理上“體陰而用陽”，而且在體用之中，“以體為本”，肝陰即肝“體”需柔、養(yǎng)、充，則肝“用”方能得到充養(yǎng)，肝氣才能條達(dá)舒暢；肝用得行得助，亦有助于肝體的補(bǔ)養(yǎng)，肝病日久，可進(jìn)一步影響脾腎功能，肝脾腎俱虛，至疾病末期自噬被啟動，通過“自我消化”方式維持微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[33]。日久濕、熱、毒、濁留滯脾胃肝膽，肝脾腎運化疏泄不利，氣機(jī)不調(diào)發(fā)，濕、熱、毒、濁的留滯進(jìn)一步導(dǎo)致全身津液氣血無法正常運行，生痰生瘀，痰瘀濕熱毒濁雜合留滯體內(nèi)，致使肝絡(luò)失養(yǎng)。濕、熱、毒、濁在某種程度上與自噬相關(guān)聯(lián)，濕、熱、毒、濁既是病理產(chǎn)物也是致病因素，而自噬被激活后，可通過自噬溶酶體對代謝產(chǎn)物進(jìn)行降解和“消化”。由此可見，肝纖維化的形成是中醫(yī)理論中濕、熱、毒、濁的微觀表達(dá)，細(xì)胞自噬則是進(jìn)行降解和清除的過程。

肝纖維化屬中醫(yī)學(xué)“臌脹”“積聚”“黃疸”“脅痛”等疾病范疇。中醫(yī)肝病專家林沛湘教授認(rèn)為，慢性肝病長期不愈，進(jìn)展為肝纖維化的中醫(yī)基本病機(jī)是肝虛瘀結(jié)。肝虛指肝臟的陰血虧竭，又兼脾腎不足，而瘀結(jié)乃瘀血及濕毒蘊結(jié)之意，故治療應(yīng)當(dāng)以養(yǎng)肝扶正逐瘀解毒為要。扶正即是壯肝，以養(yǎng)肝之陰血為主，兼顧健脾益腎；逐瘀亦要兼顧化痰解毒。壯肝逐瘀煎是在林沛湘教授治療慢性肝炎、肝炎肝硬化的經(jīng)驗方基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，組方包括靈芝20 g、黃芪20 g、當(dāng)歸10 g、絞股藍(lán)20 g、炒鱉甲20 g、田七5 g、虎杖15 g。壯肝逐瘀煎由二組藥物組成，一是補(bǔ)益藥，體現(xiàn)養(yǎng)肝扶正的治法，當(dāng)歸、靈芝、鱉甲養(yǎng)益肝腎之精血，黃芪補(bǔ)中益氣健脾，絞股藍(lán)既益氣扶正又具解毒之功；二是祛瘀解毒藥，田七、地鱉蟲、鱉甲等活血逐瘀，破積消癥，虎杖清熱利濕，活血解毒[34]。課題組前期采用高脂低蛋白食物聯(lián)合四氯化碳造模方法建立Wistar大鼠肝纖維化動物模型，發(fā)現(xiàn)壯肝逐瘀煎能加速活化的肝星狀細(xì)胞凋亡，可明顯抑制核因子κB mRNA的表達(dá)，增加肝星狀細(xì)胞中凋亡因子磷脂酰肌醇激酶、蛋白激酶B的表達(dá)，改善肝組織的纖維化程度[35-37]。因此，壯肝逐瘀煎以自噬為新靶點抗肝纖維化具有可行性。

4 結(jié) 語

在系統(tǒng)開展壯肝逐瘀煎防治肝纖維化系列研究的基礎(chǔ)上，本課題組前期研究表明壯肝逐瘀煎可能通過調(diào)控患者炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等方面防治肝纖維化。自噬是細(xì)胞分解其自身成分的必不可少的穩(wěn)態(tài)過程。然而，在復(fù)雜的多細(xì)胞生物中，自噬的核心分子機(jī)制―自噬蛋白，協(xié)調(diào)了細(xì)胞和生物對其他危險刺激(例如感染)反應(yīng)的各個方面。最近研究顯示，自噬途徑和蛋白質(zhì)在免疫和炎癥中具有關(guān)鍵作用，同時，自噬和炎癥共同調(diào)控著細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，影響著肝星狀細(xì)胞的凋亡、活化途徑從而調(diào)控肝纖維化的進(jìn)程[38]。與課題組的前期研究的結(jié)果頗有相似之處，這開啟了壯肝逐瘀煎療效機(jī)制研究的新視角。因此課題組后續(xù)將以自噬為切入點嚴(yán)密開展體內(nèi)、體外實驗，從而為壯肝逐瘀煎有效干預(yù)肝纖維化提供多層次、多角度的療效依據(jù)。