搖法對KOA兔滑膜MMPs分泌功能的作用研究*

王一洲，趙強

（1.天津市中醫藥研究院附屬醫院，天津 300120；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193）

膝骨性關節炎（KOA）是在生物力學驅動下，各種生物介質單獨或通過網絡互作形成的關節組織炎性反應。世界范圍內50歲以上人群中的KOA患病率高達42.8%[1]，KOA已經成為最重要的慢性致殘因素。KOA嚴重的危害性迫切的要求研究者們加強其防治手段的研究。

推拿手法是臨床最常用的KOA保守治療方案，推拿手法通過帶動施術部位規律地擺動或拉伸，刺激組織中機械敏感受體將力學信號轉導為生物信號，進而產生不同的手法效應[2-3]。研究表明，調節滑膜組織的異常應力是KOA的有效治療策略[4-5]，推拿手法的力學效應誘導組織細胞產生不同的界面行為，包括改變細胞的形態、黏附、增殖以及凋亡，進而產生不同層次的作用效果，影響相關組織功能[6-7]。滑膜組織病理狀態下出現向相鄰軟骨表層的遷移和滑膜內層的增生[8]，導致滑膜處于異常的力學環境，搖法是重要的運動關節類手法，其主要作用是通過多向單軸拉伸應力作用于關節，研究表明適度的拉伸應力可以誘導滑膜細胞應力重構，調控滑膜細胞的分泌功能[9]，因此，將搖法作為干預手段，研究搖法對KOA滑膜病變的作用效果，筆者制備以滑膜炎為主要表現的KOA兔模型，比較搖法和指南一線藥物塞來昔布的作用效果[10-11]，分析搖法減輕滑膜炎癥，緩解關節軟骨損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 Rabbit MMP1 ELISA KIT（BG公司，中國）；Rabbit MMP13 ELISA KIT（BG 公司，中國）；木瓜蛋白酶（Sigma公司，美國）；載玻片（碧云天公司，中國）；L-半胱氨酸（北京索萊寶科技有限公司，中國）。

1.2 儀器 MULTISKAN MK3全自動多功能酶標儀（Thermo，美國）；ⅠX71型倒置相差顯微鏡（OLMPUS，日本）；AU480全自動生化儀（OLMPUS，日本）；MDF-382E超低溫冰箱（SANYO，日本）；RM2135石蠟切片機（Leica，德國）；YJ-875型超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）；NP-P生物組織攤烤片機（孝感諾普電子科技有限責任公司）；EC-350石蠟包埋機（Microm international GmbH，德國）；洗板機（thermo，美國）。

1.3 模型制備[12]正常飲食、飲水，適應性飼養7 d，按照分組情況分別于第1、4、7天實施造模操作：按照體質量1 mL/kg，耳緣靜脈緩慢推注3%戊巴比妥鈉，待動物安靜后，仰臥位固定一側肢體，另一側膝關節周圍備皮，安爾碘消毒3遍，鋪孔巾，手持兔膝關節下段，令其屈髖屈膝外展位，將髕骨稍向內推，針頭從髕韌帶外緣向股骨髁間窩骨面刺入，直至骨面，稍退針即可開始注射。模型組、塞來昔布組、搖法組分別注入4%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液0.3 mL，注射后屈伸關節使藥液充斥關節腔。假模型組注入等量的生理鹽水溶液，正常組不做干預，同條件、同期飼養。

1.4 治療方法 塞來昔布組：予20 mg/kg藥物水溶液灌胃，1次/d，共治療21 d。搖法組等體積除菌過濾水灌胃后行手法操作，模型組、假模型組、正常組均等體積除菌過濾水灌胃。

搖法組[13]：1）助手協助將兔仰臥位固定。2）施術者一手固定股骨，一手握住足踝部，使患肢呈屈髖屈膝位。3）持足踝部手帶動膝關節行環轉搖動。手法治療每次5 min，1次/日，共治療21 d。

手法操作依據：通過前項國家自然基金研究，課題組發現單一手法的力學特性更易復制并移植到動物平臺，筆者團隊提取了具有豐富臨床經驗的高年資醫師在搖法操作時的特點，并比對文獻，膝關節搖法的操作特點在于：屈髖屈膝狀態下，操作者持肢體末端帶動治療部位做全關節的環轉運動，才能實現多向單軸拉伸的內應力，因此，課題組將動物模型的治療手法調整并設計如上。

1.5 組織樣本提取和切片 空氣栓塞處死實驗動物，沿股直肌外緣肌腱走行打開1 cm術窗，逐層分離直至打開關節腔，剪斷髕韌帶，暴露關節，注射器吸取黏稠關節液，移入凍存管。將所有采集的標本置于-80℃冰箱中凍存備用。提取關節腔內層滑膜組織，生理鹽水沖洗3遍，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋，石蠟切片，厚4 μm切片、展片，蘇木精-伊紅（HE）染色，制成病理切片。

1.6 ELISA檢測滑囊液基質金屬蛋白酶1（MMP1）、基質金屬蛋白酶3（MMP13） 取預處理滑囊液，加裂解液后進行勻漿，直至充分裂解，離心取上清液備用。采用蛋白質定量（BCA）法對組織上清液進行總蛋白定量，操作步驟嚴格按試劑盒說明進行。反應結束20 min內。使用酶標儀在570 nm下讀取OD值，繪制標準曲線并計算樣品中的總蛋白濃度。采用ELISA法檢測上清液中MMP1、MMP13含量，操作步驟嚴格按試劑盒說明書。反應終止后30 min內，使用酶標儀在450 nm下讀取OD值，繪制標準曲線并計算樣品中的MMP1、MMP13濃度。

1.7 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件對相關數據進行統計學分析，計量資料使用均數±標準差（±s）表示，各組滑囊液中 MMP1、MMP13 濃度比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，檢驗水準為α=0.05，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色顯示 正常組、假模型組滑膜襯里細胞呈單層或雙層規整的平行分布，滑膜襯里下層是疏松的網狀組織和脂肪組織，組織內可見少量淋巴細胞，無炎性細胞；模型組滑膜基質明顯增厚，可見7～8層滑膜襯里細胞，外層細胞排列致密，內層細胞排列紊亂，滑膜下層可見大量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞、漿細胞為主，箭頭所指可見毛細血管增生、血管翳形成；塞來昔布組箭頭所指處可見滑膜襯里細胞扁平，滑膜細胞增生控制良好，滑膜細胞4～5層，部分細胞形態異常，基質內少量炎性細胞，炎性浸潤明顯好于模型組；搖法組可見3～4層滑膜襯里細胞，滑膜炎性增生控制良好，細胞形態規整，箭頭所指可見少量淋巴細胞，炎性浸潤明顯好于模型組。見圖1。

圖1 各組滑膜組織HE染色（×100）Fig.1 Synovial tissues of each group were stained with HE（×100）

2.2 各組滑膜液MMP1、MMP13濃度檢測 ELISA法檢測各組滑膜液中MMP1、MMP13的表達，假模型組與正常組MMP1、MMP13的表達經統計學比較，無統計學意義（P＞0.05），模型組與正常組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05），塞來昔布組與模型組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05），搖法組與模型組比較，具有統計學差異（P＜0.05），塞來昔布組與搖法組相比，無統計學意義（P＞0.05）。提示搖法和塞來昔布均可以通過調控滑膜液中基質金屬蛋白酶的分泌，參與修飾KOA的分解代謝活動。見表1。

表1 各組滑膜組織MMP1、MMP13的表達（±s）Tab.1 Expression of MMP1，MMP13 in synovial tissues in each group（±s）

表1 各組滑膜組織MMP1、MMP13的表達（±s）Tab.1 Expression of MMP1，MMP13 in synovial tissues in each group（±s）

注：與模型組相比*P＜0.05；與正常組相比#P＜0.05。

組別 動物數 MMP1 MMP13正常組 10 3.07±0.38* 33.91±6.88假模型組 10 3.11±0.50* 33.63±5.64*模型組 10 33.70±6.80 221.84±33.45搖法組 10 11.47±2.32*# 64.10±10.93*#塞來昔布組 10 11.89±2.27*# 62.94±6.42*#

3 討論

KOA屬于中醫“骨痹”“厲節風”“骨痹痿”“膝痛”等范疇，《金匱要略》記載“中風歷節病”，臨床主要表現為“歷節痛，不可屈伸”，清楚描述KOA的癥狀和體征，并指出寒客分肉之間，即解剖學中筋膜的位置，導致經脈運行不暢產生“氣血郁滯，為腫為痛”的癥狀。搖法是推拿治療KOA的常用手法，尤其在肢體部關節如：膝關節、髖關節、肩關節等，中醫推拿以整體觀、筋骨并重為指導思想，辨證施術，標本同治，緩急兼顧，動靜結合。研究發現，搖法在KOA的臨床治療中取得了良好的療效，相比扳法、拔伸等運動關節類手法，搖法關節活動范圍大、刺激相對和緩，在改善關節活動功能、減輕滑膜炎癥方面具有獨特優勢。

在正常軟骨中，細胞外基質主要由橢圓型及圓型軟骨細胞合成，其成分主要為Ⅱ型膠原和蛋白聚糖，能夠形成纖維網絡樣結構，對軟骨細胞起支撐、保護作用，軟骨細胞分布于其中。而MMPs是軟骨中細胞外基質分解的重要酶類，能對其有高效的降解。生理情況下，MMPs和其特異性抑制劑金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）保持一定得合成和降解的比例，從而保證軟骨細胞外基質的降解能維持在一個正常的動態平衡中[14]。MMP-1是一種間質膠原酶，能夠降解間質膠原蛋白（Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ型），被認為是一種多功能分子，在多種生理過程中具有重要作用，MMP1表達和活性水平受成纖維樣滑膜細胞的機械應變調控[15]。MMP13是Ⅱ型膠原蛋白的主要水解酶，是調控軟骨細胞外纖維結構的重要因子，其表達受眾多細胞因子和其抑制劑的調控，研究表明，一些炎癥因子如：白細胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等可以通過不同途徑活化MMPs[16-17]，KOA早期的滑膜組織呈慢性炎性反應，B型滑膜細胞增殖，大量淋巴細胞和單核細胞沿滑膜內增殖的血管滲出并釋放炎癥因子，IL-1β和TNF-α作為滑膜內炎性反應的啟動子，參與關節內環境的調控，激活T細胞吞噬趨化釋放溶酶體酶，IL-1β通過誘導型一氧化氮合酶（iNOS）產生的一氧化氮（NO），活化 MMP13并抑制 TIMPs，聯合 TNF-α誘導的軟骨細胞凋亡，炎癥反應和細胞凋亡共同介導滑膜內環境和軟骨基質的重構。另有研究顯示，MMP-13和血管內皮生長因子（VEGF）水平之間存在很強的正關聯[18-19]，這也符合筆者觀察到的KOA兔滑膜內層的血管侵入現象。基于本研究的結果以及前期探索，筆者傾向于認為搖法對滑膜產生的多軸拉伸應力有利于滑膜應力環境的改善，減輕滑膜炎癥，刺激滑膜調控MMPs的分泌，緩解KOA軟骨基質分解。未來將深入探索搖法干預KOA滑膜應力環境，調控軟骨代謝的機制，為推拿手法防治KOA的研究提供依據。