基于TGFβ/Smads信號通路探討補腎促排卵湯治療PCOS大鼠卵巢纖維化的分子機制*

王旭東 ，周潔 ，，談勇 ，朱美紅 ，曹琳 ，高潔 ，仲晨霞

（1.南通市第一人民醫(yī)院，南通 226001；2.南京中醫(yī)藥大學，南京 210029；3.南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南京 210028）

多囊卵巢綜合征（PCOS）是育齡女性常見的一種生殖內(nèi)分泌疾病，全世界范圍的發(fā)生率為5%～10%[1]，該病的特征性表現(xiàn)多種多樣，包括稀發(fā)排卵、月經(jīng)紊亂、高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變等[2]。據(jù)最新的研究顯示，PCOS患者并發(fā)不孕癥、2型糖尿病、心血管疾病、惡性腫瘤和心理疾病的風險顯著增加[3-6]。PCOS的病理機制較為復雜，確切的機制至今仍不明確，目前已有的研究提示可能與下丘腦-垂體-卵巢（HPO）軸功能異常、高雄激素血癥、胰島素抵抗、卵巢功能異常、遺傳異常、卵巢纖維化相關(guān)[7-9]。目前克羅米芬為PCOS的一線促排卵藥物，由于克羅米芬對子宮內(nèi)膜與宮頸的作用以及克羅米芬抵抗等原因，出現(xiàn)排卵率高、妊娠率低的臨床結(jié)局，因此積極尋找臨床治療PCOS不孕癥的有效藥物改善PCOS不孕癥患者的妊娠結(jié)局極為必要[10]。卵巢纖維化是PCOS重要的發(fā)病機制之一，能引起卵巢功能的異常[11]，近來越來越受到關(guān)注，TGF-β/Smads信號通路在卵巢纖維化中起重要作用[9，12]。補腎促排卵湯為國醫(yī)大師夏桂成教授治療PCOS女性不孕癥的臨床經(jīng)驗方，本課題組既往研究也發(fā)現(xiàn)補腎促排卵湯聯(lián)合氯米芬治療多囊卵巢綜合癥所致不孕癥，可提高周期妊娠率，改善妊娠結(jié)局[13]。本實驗通過進一步探討國醫(yī)大師夏桂成教授臨床經(jīng)驗方補腎促排卵湯對PCOS大鼠纖維化TGF-β/Smads信號通路的影響，探討補腎促排卵湯通過調(diào)節(jié)卵巢纖維化治療PCOS的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 40只SD雌性大鼠，SPF級，3周齡，體質(zhì)量40～60 g，由南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（蘇）2016-0002。飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學實驗動物中心，環(huán)境溫度20～24℃，相對濕度60%～70%，24 h晝夜循環(huán)光環(huán)境。本實驗方案由南京醫(yī)科大學實驗動物中心審核批準。

1.1.2 藥品與試劑 補腎促排卵湯由炒當歸10 g，淮山藥 10 g，赤芍 10 g，白芍 10 g，牡丹皮 10 g，茯苓 10 g，熟地黃10 g，續(xù)斷 10 g，紅花 5 g，菟絲子10 g，五靈脂10 g，鹿角片 10 g，山茱萸 9 g。藥物由南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院提供并制備成水煎劑2.232 g/mL，4℃冰箱冷藏，臨時用生理鹽水配成相應濃度。甲苯胺藍染色液（1%硼酸鹽法）（北京索萊寶科技有限公司，G3663）；脫氫表雄酮（DHEA）（美國 APExBIO 公司，批號：B1375）。雌二醇（E2）、黃體生成激素（LH）、促卵泡激素（FSH）、睪酮（T）酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELASA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：E-EL-0152c，E-EL-R0026c，E-EL-R0391c，E-EL-0155c）；蘇木精-伊紅染色（HE）試劑盒及天狼猩紅染液試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：G1005，G1018）；生物素標記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）標記二抗、生物素標記驢抗山羊IgG標記二抗（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：GB23303、GB23404）；轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：21898-1-ap），p-Smad3及Smad7抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：GB11174、GB1511）；SYBR Green（瑞士羅氏公司，批號 04913914001）；ECL 發(fā)光試劑盒（美國Thermo公司，批號32209）；β-actin（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：GB11001）。

1.1.3 實驗儀器 Rt2100c型酶標檢測儀（美國Rayto公司）；neofuge 13R型冷凍離心機（中國heal force公司）；V300型掃描儀（中國EPSON公司）；Image J分析軟件（美國National Institutes of Health公司）；Adobe PhotoShop型圖像分析軟件（美國Adobe公司）；KZ-Ⅱ型勻漿儀，TSY-B型脫色搖床，ML-1600型平板顯微鏡（中國武漢賽維爾生物科技有限公司）；NanoDrop2000超微量分光光度計（美國Thermo公司）；AJC-0501-P純水儀（中國重慶艾科浦公司）；RM2016病理切片機（中國上海徠卡儀器有限公司）；JJ-12J脫水機、JB-P5包埋機（中國武漢俊杰電子有限公司）；Stepone plus熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；DYCZ-24DN型雙垂直電泳儀，DYCZ-40D型轉(zhuǎn)印電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組及給藥 40只SD大鼠，適應性飼養(yǎng)3 d后，隨機分為空白組8只及脫氫表雄酮（DHEA）給藥組32只，DHEA給藥組每日頸部皮下注射DHEA 60 mg/kg溶于0.2 mL注射用大豆油中，空白組每日頸部皮下注射0.2 mL注射用大豆油，連續(xù)給藥35 d[12]，造模第20天開始于每日上午9∶00-10∶00制作大鼠陰道涂片，觀察大鼠動情周期，大鼠失去規(guī)律的動情周期即為造模成功。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、補腎促排卵湯低、中、高劑量組，每組8只，各組間SD大鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。補腎促排卵湯臨床70 kg成人用量為124 g/d（生藥）。按照體表面積法換算，補腎促排卵湯低、中、高劑量組分別予以5.58、11.16、22.32 g/kg生藥（相當于臨床70 kg成人等效量的0.5、1、2倍）。各組藥物臨用前按照10 mg/kg給藥體積，用生理鹽水配成適當濃度，連續(xù)灌胃給藥4周，每日1次。同時空白組與模型組大鼠灌胃給予等量生理鹽水。

1.2.2 動情周期的檢查 給藥第16天開始，每天上午9點到10點，用生理鹽水蘸濕棉簽行陰道涂片檢查，來判斷大鼠的動情周期：動情前期（P）：以橢圓形有核上皮細胞為主，伴有少量菱形角化上皮及白細胞；動情期（E）：以菱形角化上皮為主，伴有少量橢圓形有核上皮細胞及白細胞；動情后期（M）：橢圓形有核上皮細胞、菱形角化上皮、白細胞比例相當；動情間期（D）：以白細胞為主，伴有少量菱形角化上皮及橢圓形有核上皮細胞。

1.2.3 血清性激素水平的檢測 腹主動脈取血收集血樣，立即離心分離，取血清保存在-80℃留以后續(xù)性激素的檢測。據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測血清中 E2、T、LH、FSH 水平。

1.2.4 大鼠卵巢組織病理形態(tài)的檢查 取大鼠卵巢標本，使用4%多聚甲醛進行固定，石蠟包埋。石蠟切片厚度為4 μm。采用HE染色法對部分卵巢石蠟切片進行染色，在普通光學顯微鏡下觀察各大鼠卵巢中卵泡的形態(tài)變化。采用天狼星紅染色法對部分卵巢石蠟切片進行染色，在普通光學顯微鏡下對卵巢組織切片中纖維化部位進行采集，應用Image J軟件進行纖維化陽性面積半定量分析[14]。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）法檢測大鼠卵巢 TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA 的表達 將100 mg卵巢冰凍組織加進勻漿管，用勻漿儀充分研磨，使用Trizol試劑提取卵巢樣本總RNA，離心半徑10 cm，12 000 r/min，離心10 min后吸取上清液，加入250 μL三氯甲烷，接著顛倒離心管15 s，予充分混勻，靜置3 min，在4℃離心半徑10 cm，12 000 r/min離心10 min，把上清液轉(zhuǎn)移到另一新離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻，-20℃放置15 min，4℃下離心半徑10 cm，12 000 r/min離心10 min，吸除液體加接著入75%乙醇1.5 mL洗滌沉淀，4℃下12 000 r/min離心5 min，液體吸除干凈后再將離心管置于超凈臺上吹3 min，加入15μL無RNA酶的水溶解RNA，55℃孵育5 min，用Nanodrop 2000測出RNA的純度和濃度。接著根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應條件：65℃5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。RT-PCR檢測，反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 sec，60 ℃ 60 sec，循環(huán)40 次。以內(nèi)參基因 β-actin 為參照，采用 2-ΔΔCT方法測定目的基因水平的變化。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.2.6 Western Blot法測定大鼠卵巢 TGF-β1、p-Smad3、Smad7的蛋白表達 使用RIPA裂解緩沖液提取卵巢中總蛋白，將裂解后的混合物置于冰上保存15 min，然后于4℃離心半徑10 cm，12 000 r/min離心10 min，取上清液進行Western Blot分析。取蛋白質(zhì)樣品加入10%SDS-PAGE凝膠中進行電泳分離，樣品的濃縮壓為75 V，分離壓為120 V。接著將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯氟（PVDF）膜，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜，0.5 h后取出PVDF膜，保留目的蛋白條帶及內(nèi)參蛋白條帶，用5%脫脂牛奶封閉1 h，再用TBST清洗。將目標條帶分別孵育于一抗TGF-β1、p-Smad3、Smad7、β-actin中4℃過夜。第2天將PVDF膜洗凈后，于室溫下孵育二抗1 h，再用TBST溶液洗凈。接著滴加ECL發(fā)光液，使用化學成像儀檢測目的蛋白的含量。采用Image J軟件對目標條帶進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，不符合正態(tài)分布或方差齊的組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 補腎促排卵湯對各組大鼠動情周期的影響 空白組大鼠出現(xiàn)規(guī)律的動情周期，與空白組相比，PCOS模型組大鼠喪失規(guī)律的動情周期，且長時間處在動情間期，給予補腎促排卵湯治療后，補腎促排卵湯中、高劑量組可有效地逆轉(zhuǎn)這一病理變化，且高劑量組的效果更明顯。見圖1，圖2。

圖1 大鼠動情周期陰道分泌物細胞形態(tài)（甲苯胺藍染色，×100）Fig.1 Cell morphology of vaginal secretions during estrous cycle in rats（Toluidine blue staining，×100）

圖2 補腎促排卵湯對各組大鼠動情周期的影響Fig.2 Effects of Bushen Cupailuan Decoction on estrous cycle of rats in each group

2.2 補腎促排卵湯對各組大鼠血清性激素水平的影響 與空白組相比，模型組血清T、LH水平顯著升高（P＜0.01），血清 E2、FSH 水平變化無統(tǒng)計學差異；與模型組相比，補腎促排卵湯低中高劑量組血清T水平及LH水平均有不同程度地降低，其中補腎促排卵湯高劑量組降低最為明顯（P＜0.01）。見表2。

表2 補腎促排卵湯對大鼠血清性激素水平的影響（±s）Tab.2 Effect of Bushen Cupailuan Decoction on serum sex hormone levels in rats（±s）

表2 補腎促排卵湯對大鼠血清性激素水平的影響（±s）Tab.2 Effect of Bushen Cupailuan Decoction on serum sex hormone levels in rats（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白組模型組補腎促排卵湯低劑量組補腎促排卵湯中劑量組補腎促排卵湯高劑量組動物數(shù)8 8 8 8 8劑量（g/kg）T（ng/mL）E2（pg/mL）LH（mU/mL）FSH（ng/mL）-0.80±0.24 60.36± 8.15 9.31±1.21 14.70±3.75-3.83±0.59* 70.22± 8.67 39.09±6.25* 12.12±3.77 5.58 3.38±0.69 68.41± 9.62 33.70±2.58# 9.78±4.10 11.16 2.92±0.59## 67.69±11.33 26.05±5.54## 15.26±2.72 22.32 1.84±0.51## 67.13±12.28 20.16±3.95## 13.65±3.71

2.3 補腎促排卵湯對各組大鼠卵泡發(fā)育及卵巢纖維化的影響 空白組大鼠卵巢組織切片鏡下可見多個黃體及不同階段發(fā)育的卵泡，極少見囊性擴張卵泡；模型組大鼠卵巢呈多囊樣改變，可見囊狀擴張的卵泡，黃體數(shù)目顯著減少，卵泡內(nèi)顆粒細胞層較空白組減少；經(jīng)補腎促排卵湯低中、高劑量組治療后上述病理改變可被有效改善，與模型組相比，補腎促排卵湯低、中、高劑量組卵巢組織中囊狀擴張的卵泡減少，黃體數(shù)目增多，顆粒細胞層增厚，其中補腎促排卵湯高劑量組改善最為明顯。見圖3。與空白組相比，模型組大鼠卵巢纖維化陽性面積增多（P<0.01）；與模型組相比，補腎促排卵湯低中高劑量組纖維化陽性面積均較模型組降低，且高劑量組的變化最為明顯（P<0.01）。見圖4，表3。

表3 補腎促排卵湯對各組大鼠卵巢纖維化陽性面積的影響（±s）Tab.3 Effect of Bushen Cupailuan Decoction on positive area of ovarian fibrosis of rats in each group（±s）%

表3 補腎促排卵湯對各組大鼠卵巢纖維化陽性面積的影響（±s）Tab.3 Effect of Bushen Cupailuan Decoction on positive area of ovarian fibrosis of rats in each group（±s）%

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別空白組模型組補腎促排卵湯低劑量組補腎促排卵湯中劑量組補腎促排卵湯高劑量組動物數(shù)8 8 8 8 8劑量（g/kg） 纖維化面積（%）-8.50±1.92- 17.63±1.86*5.58 16.70±1.37 11.16 14.27±1.10#22.32 12.26±1.09#

圖3 PCOS大鼠卵巢內(nèi)卵泡發(fā)育的變化（HE染色，×40）Fig.3 Changes of follicular development in ovaries of PCOS rats（HE staining，×40）

圖4 PCOS大鼠卵巢纖維化的變化（天狼猩紅染色，×100）Fig.4 Changes of ovarian fibrosis in ovaries of PCOS rats（Sirius red staining，×100）

2.4 補腎促排卵湯對各組大鼠卵巢組織TGF-β1，Smad3，Smad7mRNA的影響 與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織TGF-β1、Smad3 mRNA表達顯著升高，Smad7 mRNA 表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，補腎促排卵湯中、高劑量組的TGF-β1 mRNA表達均程度不等地降低（P<0.05，P<0.01）；補腎促排卵湯中、高劑量組Smad3 mRNA表達均程度不等地降低（P＜0.01）；補腎促排卵湯中、高劑量組Smad7 mRNA 的表達均程度不等地升高（P＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表4 補腎促排卵湯對各組大鼠卵巢組織TGF-β1，Smad3，Smad7 mRNA的影響（±s）Tab.4 Effect of Bushen Cupailuan Decoction on TGF-β1，Smad3，Smad7 mRNA of ovarian of rats in each group（±s）

表4 補腎促排卵湯對各組大鼠卵巢組織TGF-β1，Smad3，Smad7 mRNA的影響（±s）Tab.4 Effect of Bushen Cupailuan Decoction on TGF-β1，Smad3，Smad7 mRNA of ovarian of rats in each group（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白組模型組組補腎促排卵湯低劑量組補腎促排卵湯中劑量組補腎促排卵湯高劑量組動物數(shù)8 8 8 8 8劑量（g/kg） TGFβ1 Smad3 Smad7-1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00-4.23±0.20** 6.48±0.43** 0.21±0.04**5.58 3.81±0.17 2.98±0.23 0.30±0.03 11.16 1.96±0.08# 1.10±0.08## 0.49±0.07#22.32 1.47±0.09## 1.09±0.08## 0.78±0.07##

2.5 補腎促排卵湯對各組大鼠卵巢組織TGF-β1、p-Smad3、Smad7蛋白表達的影響 與空白組相比，模型組大鼠卵巢中TGF-β1、p-Smad3的蛋白表達均顯著升高，Smad7表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，補腎促排卵湯中、高劑量組大鼠卵巢中TGF-β1、p-Smad3 蛋白表達顯著下調(diào)，Smad7 蛋白表達顯著上調(diào)，其中以補腎促排卵湯高劑量組變化程度最顯著（P＜0.01）。見圖 5、表 5。

表5 補腎促排卵湯對各組大鼠卵巢組織TGF-β1、p-Smad3、Smad7蛋白表達的影響（±s）Tab.5 Effect of Bushen Cupailuan Decoction on expression of TGF-β1，p-Smad3，Smad7 of ovarian of rats in each group（±s）

表5 補腎促排卵湯對各組大鼠卵巢組織TGF-β1、p-Smad3、Smad7蛋白表達的影響（±s）Tab.5 Effect of Bushen Cupailuan Decoction on expression of TGF-β1，p-Smad3，Smad7 of ovarian of rats in each group（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組別空白組模型組補腎促排卵湯低劑量組補腎促排卵湯中劑量組補腎促排卵湯高劑量組動物數(shù)8 8 8 8 8劑量（g/kg） TGFβ1/β-actin p-Smad3/β-actin Smad7/β-actin-0.22±0.08 0.29±0.05 0.93±0.05-0.73±0.09** 0.89±0.06** 0.47±0.06**5.58 0.70±0.03 0.82±0.06 0.50±0.08 11.16 0.52±0.11## 0.76±0.07## 0.61±0.07##22.32 0.30±0.07## 0.48±0.04## 0.85±0.05##

圖5 大鼠卵巢組織TGF-β1、p-Smad3、Smad7蛋白表達電泳圖Fig.5 Electrophoresis of TGF-β1，p-Smad3，Smad7 protein expressions in ovarian tissue of rats

3 討論

中醫(yī)根據(jù)PCOS的臨床表現(xiàn)可將其歸類于“閉經(jīng)”“月經(jīng)后期”“崩漏”“不孕”等疾病的范疇。其中，PCOS女性不孕可歸類于“不孕”范疇。《圣濟總錄婦人無子》中指出：“婦人所以無子者……腎氣虛弱故也。”《素問·上古天真論》中指出：“女子七歲，腎氣盛……二七天癸至，任脈通……月事以時下，故有子……七七任脈虛，太沖脈衰少……故形壞而無子。”《醫(yī)學衷中參西錄》亦指出：“男女生育，皆賴腎氣作強……腎氣旺自能蔭胎也。”腎乃是先天之本，可藏精主生殖；卵子為生殖之精，腎精充腎氣盛，故腎主生殖的功能才能正常，卵子才能成熟從而順利地排出，綜上，腎虛是PCOS不孕的發(fā)病基礎(chǔ)。同時不少醫(yī)家認為PCOS腎虛還夾雜著瘀血，為本虛標實，腎虛日久，血液運行不暢則瘀血內(nèi)阻[15-16]。國醫(yī)大師夏桂成教授認為[17]PCOS之所以排卵障礙，大多是與腎虛有關(guān)，所以補腎為前提，結(jié)合活血通絡(luò)，以祛瘀生新方法從而使成熟的卵子突破卵巢表層以促發(fā)排卵。

補腎促排卵湯為國醫(yī)大師夏桂成教授治療PCOS女性不孕癥的臨床經(jīng)驗方，藥物組成：炒當歸 10 g，懷山藥 10 g，赤芍 10 g，白芍 10 g，牡丹皮10 g，茯苓10 g，熟地黃 10 g，川續(xù)斷 10 g，紅花5 g，菟絲子 10 g，五靈脂 10 g，鹿角片 10 g，山茱萸9 g。夏桂成教授認為，方以歸芍地黃湯為基礎(chǔ)，以滋補腎陰，腎陰充實，癸水高漲，才可能排卵，故腎陰癸水是排卵的基礎(chǔ)；方中續(xù)斷、菟絲子、鹿角片者，為溫補腎陽也，溫補腎陽，以陽中扶陰；當歸、赤芍、五靈脂、紅花活血化瘀，以祛瘀生新方法，使成熟的卵子突破卵巢表層以促發(fā)排卵[13，15]。現(xiàn)代研究表明，補腎活血類中藥方可以改善卵巢纖維化。劉碧源等[18]使用護卵湯治療慢性應激超排卵小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組卵巢組織的 TGF-β1、FSHR、p-Smad3蛋白表達較正常組同期均顯著降低（P<0.05）；與模型組同期比較，中藥組和西藥組卵巢TGF-β1、FSHR、p-Smad3蛋白表達均明顯升高（P<0.05）。柴海蘭等[19]用歸腎丸與針刺治療PCOS排卵障礙性不孕癥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)歸腎丸聯(lián)合針刺能有效地提高PCOS不孕癥患者的臨床治療效果，于治療3個月后與停藥4個月后，治療組卵巢組織中結(jié)締組織生長因子（CTGF）、TGF-β1的蛋白水平均低于對照組。隨訪1年時間內(nèi)，治療組妊娠率高于對照組。現(xiàn)代藥理證實，該補腎促排卵湯中多種中藥的活性成分具有不同的抑制TGF-β1/Smad的抗纖維化作用。丹皮，主要成分丹皮酚，對肝星狀細胞活化α-SMA蛋白的表達產(chǎn)生明顯抑制[20]；紅花，主要成分羥基紅花黃色素A，能夠抑制TGF-β1誘導NIH/3T3細胞與肺纖維化相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導，并可呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，作用靶點可能是TGF-βRII[21]；赤芍，主要成分赤芍總苷，具有明顯的抗肝纖維化作用，其機制可能與其阻斷TGF-β1/Smad信號傳導通路有關(guān)[22]；茯苓，主要成分茯苓多糖，可以防治大鼠的腎間質(zhì)纖維化[23]；熟地黃均能緩解腎間質(zhì)纖維化，其作用機制可能與下調(diào)TGF-β1、Collagen-Ⅰ及 α-SMA 的表達有關(guān)[24]。

在1982年，Hughesdon第一次證實了PCOS患者共有的卵巢纖維化特征，即卵巢皮質(zhì)及皮質(zhì)下基質(zhì)增厚[25]。纖維化性疾病由于細胞外基質(zhì)的過量生成、沉積和收縮導致過多疤痕形成[26]。TGF-β為轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族中非常重要的一員，包括三種亞型：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中 TGF-β1 與纖維化的形成密切相關(guān)，誘導和激活多種纖維化疾病[27]。Smads蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子-β受體（TGF-βR）的直接作用底物，是生物信號從胞漿傳遞到細胞核內(nèi)的關(guān)鍵效應分子，活化的Smads蛋白進入核內(nèi)后共同激活或者抑制與它們相對應的目的基因的轉(zhuǎn)錄。TGF-β/Smads通路是TGF-β超家族傳遞信號的經(jīng)典途徑，已被證實在組織器官的纖維化中發(fā)揮重要作用[28]。TGF-β使受體磷酸化，然后激活Smad2/Smad3使其磷酸化，磷酸化的Smad2/Smad3（p-Smad2/p-Smad3）與Smad4形成低聚體復合體，這些低聚體復合物轉(zhuǎn)位到細胞核并調(diào)節(jié)纖維化相關(guān)基因的表達[29]，使有促纖維化生長因子分泌增多，使得細胞外基質(zhì)（ECM）降解減少沉積增多，造成組織纖維化。該纖維化過程同時受負反饋機制的調(diào)節(jié)，Smad7能抑制TGF-β1/Smad信號通路的活性[30]。卵巢纖維化的原因可能是顆粒細胞的變性導致間質(zhì)成纖維細胞增生、纖維蛋白原和膠原蛋白的沉積，TGF-β激活 Smad3和 Smad2，隨后 TGF-β/Smads復合體可能促進CTGF、fibronectin和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）在細胞核中的轉(zhuǎn)錄[12，31]。最新的研究表明，DHEA誘導的PCOS模型大鼠卵巢纖維蛋白和膠原蛋白水平顯著提高，而主要纖維化指標TGF-β、p-Smad3等明顯升高，TGF-βR抑制劑SB431542可以下調(diào)TGF-β、p-Smad3等纖維化相關(guān)因子的表達，卵巢過度纖維化可以通過TGF-βR抑制劑來改善，抑制促纖維化基因的轉(zhuǎn)錄[12]。

本研究結(jié)果顯示，補腎促排卵湯可有效改善PCOS大鼠動情周期，降低血清T、LH水平，改善卵泡發(fā)育，減少囊狀擴張的卵泡數(shù)量，減少卵巢纖維化形成，下調(diào)卵巢TGF-β1、p-Smad3蛋白及mRNA的表達，上調(diào)Smad7蛋白及mRNA的表達，有效治療PCOS模型大鼠；補腎促排卵湯治療PCOS模型大鼠可能的機制是通過調(diào)節(jié)纖維化TGF-β/Smads信號通路上重要分子 TGF-β1、p-Smad3、Smad7 的表達從而發(fā)揮作用。但PCOS卵巢纖維化的發(fā)病機制復雜，參與的信號通路眾多，同時中藥復方的作用常常又具有多靶點，因此，補腎促排卵湯改善PCOS模型大鼠卵巢纖維化的作用機制仍需進一步研究。