腸復方對腸癌荷瘤小鼠MDSCs及免疫相關細胞因子表達的影響*

林宏遠 ，鄧湘琴 ，崔超宇 ，任麗芝 ，李寧 ，梁慧

（1.湖南中醫藥大學，長沙 410208；2.湖南省腫瘤醫院，長沙 410013）

結直腸癌（CRC）是中國常見惡性腫瘤之一，近年來發病率明顯升高。該病傳統的治療方法有手術、藥物、放化療等，但總體生存率仍不理想[1]。免疫治療是繼手術、放療、化療及靶向治療后新興的惡性腫瘤治療手段，結直腸癌發生發展與免疫微環境密切相關。其中髓源抑制性細胞（MDSCs）是一群來源于骨髓異質性的未成熟細胞，介導機體的免疫抑制。據報道，大多數腫瘤可以觀察到外周血和腫瘤組織中MDSCs比例升高，且與腫瘤的進展密切相關[2]。免疫相關細胞因子是由多種組織細胞產生的小分子蛋白質，參與調節機體免疫功能及腫瘤消長等。目前，針對局部腫瘤組織MDSCs表達與血清細胞因子的相關性研究較少。中醫藥辨證治療結直腸癌具有抗復發和轉移、提高生存質量、調節免疫力、延長生存期等作用的特點[3-4]。腸復方是湖南省腫瘤醫院中西醫結合科治療大腸癌的協定方，臨床應用腸復方診治了大量患者，療效較好。在筆者的前期研究中證實，腸復方可改善患者癥狀，提高生存質量；改善患者的細胞免疫功能[5]。在對腸癌荷瘤小鼠的干預中發現，腸復方可誘導腸癌原位移植裸鼠移植瘤細胞凋亡，抑制細胞增殖[6]。本實驗在前期研究的基礎上選擇腸復方中劑量組（3.6 g/mL）為最佳給藥濃度，檢測MDSCs、細胞因子的表達，并分析局部腫瘤組織中MDSCs與血清免疫相關細胞因子的相關性研究，進一步探討腸復方的免疫調節機制。

1 材料

1.1 動物和細胞株 BALB/c小鼠，4～6周齡，40只（實驗動物合格證號：4300470059729，實驗動物使用編號：00190458），購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK（湘）2016－0002]。動物實驗符合湖南省中醫藥研究院實驗動物倫理委員會規定，在湖南省腫瘤醫院動物實驗中心無特定病原體（SPF）條件下飼養，予以自由飲食。小鼠結腸癌細胞株CT26，購自中國醫學科學院細胞庫，編號ZQ0190。

1.2 藥物 腸復方藥物：黨參10 g，黃芪30 g，白術15 g，陳皮 10 g，麥芽 15 g，雞內金 15 g，薏苡仁30 g，香附 15 g，郁金 15 g，莪術 15 g，地鱉蟲 15 g，半枝蓮30 g，白花蛇舌草30 g，壁虎10 g，茯苓10 g，女貞子10g，甘草5g。以上中藥均購自湖南省腫瘤醫院中藥房，以上中藥經湖南省腫瘤醫院藥劑科中藥鑒定員鑒定后使用。溫水浸泡1 h，水量超出藥物3～5 cm，大火煮沸后轉小火煎30 min，趁熱過濾，藥渣按前法再煎煮2次，將3次藥液混勻、過濾，恒溫水浴箱上濃縮為相當于含生藥3.6 g/mL，4℃保存備用。

香菇菌多糖片（湖北廣仁藥業有限公司，規格：10mg/片，批號：1903010），用蒸餾水配制成 0.26mg/mL藥液冷藏備用。

1.3 實驗試劑 胎牛血清（以色列BI公司，批號：1922693）；RPMI 1640（美國 Sigma公司，批號：RNBH 5043）；PBS液（美國Hyclone公司，批號：AE27749269）；青霉素和鏈霉素混合液（上海碧云天生物技術有限公司，批號：SV30010）；0.25% 胰蛋白酶（上海碧云天生物技術有限公司，批號：C0201）；紅細胞裂解液（美國 eBioscience公司，批號：00-4333-57）；CD11b流式抗體（美國eBioscience公司，批號：11-0112-81）；GR-1流式抗體（美國eBioscience公司，批號：12-593-81）；IL-2 ELISA 試劑盒（美國 Proteintech公司，批號：KE10004）；TNF-αELISA 試劑盒（美國Proteintech 公司，批號：KE10002）；IL-10 ELISA 試劑盒（美國 Proteintech公司，批號：KE10008）；TGF-β ELISA試劑盒（美國Proteintech公司，批號：KE10005）；Gr-1第一抗體（美國Santa公司，批號：sc-53515）；二步法試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：PV-9000）；DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：ZLI-9018）。

1.4 實驗儀器 超凈工作臺（北京亞泰隆，型號YT-CJ-2NB）；二氧化碳培養箱（上海三藤儀器廠，型號DH-160I）；倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業儀器儀表有限公司，型號DSZ2000X）；流式細胞分析儀（Beckman公司）；臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：H1650R）；全自動酶標洗板機（深圳市匯松科技發展有限公司，型號：PW-812）；多功能酶標分析儀（深圳市匯松科技發展有限公司，型號：MB-530）；搖床（其林貝爾公司，型號：TS-92）；切片刀（萊卡公司，型號：M199）；切片機（浙江金華益迪試驗器材公司，型號：YD-315）；包埋機（常州中威電子儀器公司，型號：BMJ-A）；精密PH計（上海儀電科學儀器股份有限公司，型號：E-201-C）；蓋玻片、載玻片（海門遠泰實驗器材廠，型號：DY89-1，AY89-2）。

2 方法

2.1 腫瘤造模

2.1.1 單細胞懸液制備 常規復蘇CT26細胞，將細胞培養10%胎牛血清RPMI 1640培養液中；置于37℃、含5%的CO2培養箱內培養并傳代。用0.25%胰蛋白酶消化收集對數生長期的細胞，使用PBS液配制成細胞密度為1×107/mL的單細胞懸液。

2.1.2 皮下移植瘤模型建立 取細胞濃度為1×107/mL的CT26細胞懸液0.1mL，即接種細胞數為1×106/mL，分別注射到30只BALB/c小鼠的右腋下，建立小鼠結腸癌皮下移植瘤模型。

2.2 動物分組及給藥方法 選取SPF級BALB/c小鼠40只，隨機抽取10只為空白對照組，將其余30只小鼠采用動物移植性腫瘤實驗法造模。按隨機數字表法將造模成功的30只BALB/c小鼠隨機分為3組，即腸復方組、香菇多糖組和模型組，每組10只。于造模后第7天皮下種植瘤生長至1 cm左右時開始干預，按70 kg人腸復方使用劑量給予小鼠相應等效劑量，小鼠腸復方按照每日使用劑量為36 g/kg灌胃給藥，小鼠香菇菌多糖片使用劑量為5.2 mg/kg，模型組、空白對照組給予蒸餾水。以上藥液每次灌胃0.2 mL，每天灌胃1次，每周5 d，連續干預4周。

2.3 常規觀察 每天記錄小鼠精神狀態、活動情況、飲食、大小便，每周測定小鼠體質量。

2.4 取材及處理 干預結束后24 h水合氯醛麻醉小鼠，采取摘除眼球法收集小鼠血液，抗凝、離心分離并收集血清、血細胞備用；脫頸處死小鼠，剝離腫瘤，稱質量并記錄。計算各組小鼠的抑瘤率。抑瘤率=（1-實驗組平均瘤質量/模型組平均瘤質量）×100%。

2.5 ELISA 檢測荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α、TGF-β、IL-10表達 取小鼠血液約0.8 mL，3 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min后取上清液，ELISA法評估血中 TNF-α、IL-2、TGF-β、IL-10 血漿因子含量。具體操作方法按ELISA試劑盒說明書進行。

2.6 免疫組化檢測荷瘤小鼠瘤體MDSCs表達 從上述移植瘤標本取癌組織，按常規程序脫水、固定、切片制成組織切片。滴加I抗（抗Gr-1）孵育后PBS清洗4次，Ⅱ抗孵育25 min后PBS清洗4次，DAB顯色，封片，拍照。顯微鏡下陽性表達定位于細胞核，以每張切片超過10%或呈棕黃色者為陽性表達。顯微鏡下每張切片選擇3個視野，放大400倍下觀察視野中陽性細胞表達個數。免疫組化染色圖像結果使用IPP（Image-Pro Plus 6.0）軟件進行分析。測量集成光密度及面積，計算平均光密度（IOD）=集成光密度/面積，用平均光密度評價MDSCs的表達水平。

2.7 流式細胞儀檢測瘤體中MDSCs浸潤情況 將小鼠瘤體取出，研磨消化制成單細胞懸液，200目尼龍網過濾，加入CD11b、Gr-1流式抗體染色，避光孵育30 min，300 r/min，離心半徑 10 cm，離心 5 min，棄上清液后用PBS清洗2次；用1%多聚甲醛定容至300 μL，過350目濾網。4℃避光保存，流式上機檢測。CD11b+和Gr-1+雙陽性的為MDSCs細胞。

2.8 統計學分析 采用SPSS 25.0統計學軟件進行分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，相關性分析行Spearman相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 對小鼠一般狀態、體征的影響 模型組小鼠精神狀態較差，進食減少。香菇多糖組小鼠精神狀態一般，稍有消瘦，飲食量稍減少。腸復方組小鼠飲食量未見減少，精神、活動、二便正常。

3.2 各組荷瘤小鼠的抑瘤率比較 模型組平均瘤體質量為4.342 g；腸復方組平均瘤體質量為3.176 g，與模型組相比，抑瘤率為26.9%，差異具有統計學意義（P＜0.01）；香菇多糖組平均瘤體質量為3.723 g，與模型組相比，抑瘤率為14.3%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。

表1 各組CT26荷瘤小鼠的抑瘤率比較Tab.1 Comparison of tumor inhibition rate of CT26 tumor-bearing mice in each group

3.3 藥物對各組小鼠外周血中IL-2、TNF-α、IL-10、TGF-β表達的影響 與空白對照組相比，模型組中 IL-2、TNF-α、IL-10、TGF-β 的表達均明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，腸復方組、香菇多糖組荷瘤小鼠外周血中TNF-α、IL-2的表達顯著升高（P＜0.01），同時 IL-10、TGF-β 的表達則明顯降低（P＜0.01，P＜0.05），且腸復方組均優于香菇多糖組（P＜0.01）。見表 2。

表2 ELISA檢測CT26荷瘤小鼠血液中TNF-α、IL-2、IL-10、TGF-β 在各組的表達（±s）Tab.2 Expression of TNF-α，IL-2，IL-10 and TGF-β in blood of CT26 tumor-bearing mice in each group detected by ELISA（±s）pg/mL

表2 ELISA檢測CT26荷瘤小鼠血液中TNF-α、IL-2、IL-10、TGF-β 在各組的表達（±s）Tab.2 Expression of TNF-α，IL-2，IL-10 and TGF-β in blood of CT26 tumor-bearing mice in each group detected by ELISA（±s）pg/mL

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與香菇多糖組比較，△△P＜0.01。

組別 動物數 IL-2 TNF-α IL-10 TGF-β空白對照組 10 21.29±0.54 12.43±0.62 23.22±0.48 54.66±2.16模型組 10 31.07±0.80**40.88±2.86**59.98±1.13**220.84±2.44**腸復方組 10 56.58±1.07#△△ 84.70±1.97#△△ 42.22±1.73#△△ 102.74±3.05#△△香菇多糖組 10 41.64±1.01# 55.66±2.57# 52.62±1.09## 182.34±2.34#

3.4 藥物對CT26荷瘤小鼠瘤體中MDSCs表達含量的影響 在對荷瘤小鼠瘤體的檢測中發現，與模型組相比，腸復方組、香菇多糖組均能夠顯著下調MDSCs的表達（P＜0.01），且腸復方組優于香菇多糖組，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見圖1。

圖1 免疫組化檢測CT26荷瘤小鼠瘤體中MDSCs（Gr-1）在各組的表達（±s，n=10）Fig.1 Expression of MDSCs(Gr-1)in tumor of CT26 tumor-bearing mice in each group detected by IHC（±s，n=10）

3.5 藥物對CT26荷瘤小鼠瘤體中MDSCs比例的影響 模型組、腸復方組、香菇多糖組MDSCs比例分別為為35.02%、21.88%、27.19%，較模型組相比，腸復方組MDSCs比例顯著下降（P＜0.01），香菇多糖組也可抑制MDSCs的增殖（P＜0.01），但作用不及腸復方組顯著（P＜0.01）。見圖 2。

圖2 流式細胞儀檢測CT26荷瘤小鼠瘤體中MDSCs在各組的表達（±s，n=10）Fig.2 Expression of MDSCs in tumor of CT26 tumorbearing mice in each group detected by Flow cytometry（±s，n=10）

3.6 瘤體中MDSCs與瘤體質量的相關性分析 對模型組小鼠瘤體稱質量記錄后，將MDSCs與瘤體質量進行Spearman等級相關分析發現，MDSCs與瘤體質量呈正相關（r=0.719，P=0.044）。即說明隨著瘤體負荷的增加，瘤體中MDSCs的表達亦隨之升高。

3.7 瘤體中MDSCs與相關免疫因子的相關性分析 針對模型組小鼠瘤體中MDSCs表達含量與模型組小鼠血清免疫因子表達含量進行Spearman相關性分析。分析發現，MDSCs 與 IL-10、TGF-β、TNF-α 均具有相關性（P＜0.05），與 IL-2不具有相關性（P＞0.05）。其中MDSCs與IL-10呈正相關（r=0.725，P<0.05），與 TGF-β 亦呈正相關（r=0.813，P<0.05）；MDSCs與 TNF-α 呈負相關（r=-0.757，P<0.05）。

4 討論

本研究在既往臨床及實驗證實腸復方有效性基礎上，進一步研究腸復方對于結直腸癌的免疫調節機制。研究發現，腸復方可抑制結直腸癌荷瘤小鼠瘤體的生長，同時對小鼠的一般狀態、體征等有積極影響。

從中醫角度，在大腸癌的發生發展中，脾氣虛弱為本，而又水停濕聚，釀成痰濕毒瘀蘊結腸腑，聚成為積。魏聰等[7]提出“脾腎虧虛”是惡性腫瘤的發病基礎。此外，痰瘀氣火毒相夾是大腸癌發生發展的的重要病機。腸復方是治療結直腸癌的專方，具有健脾益氣、祛濕化瘀解毒之功效?，F代藥理表明，健脾益氣類方藥可通過提高機體免疫狀態、改善腫瘤上皮間質轉化達到抗腫瘤的目的[8-9]；活血化瘀解毒類中藥可通過抑制腫瘤血管生成、改善機體免疫力狀態發揮抗腫瘤作用[10]。故腸復方全方配伍既能抑制腸癌瘤體生長，又能穩定小鼠的一般狀態，療效最佳。既往研究顯示[11-12]，香菇多糖可以拮抗結直腸癌發生發展，并且具有一定的免疫調節功能，作為免疫調節劑廣泛運用于臨床，故本實驗研究采用香菇多糖作為陽性對照。

MDSCs作為結直腸癌腫瘤微環境中重要的免疫抑制細胞，在接種腫瘤后，會大量擴增和活化，募集到腫瘤和外周血中，從而對機體的免疫系統起到抑制作用，導致腫瘤細胞發生免疫逃逸[13-15]。在結直腸癌發生發展的過程中，MDSCs與腫瘤細胞都可高表達TGF-β、IL-10等免疫抑制因子參與腫瘤細胞的免疫耐受和免疫抑制。研究發現[16]，TGF-β可直接或間接地作用于免疫細胞，從而誘導其功能喪失，幫助腫瘤細胞逃避機體的免疫監視，促進腫瘤的發展。IL-10作為免疫逃逸的重要免疫抑制性因子，能抑制腫瘤浸潤炎癥細胞，使這些細胞在腫瘤組織中的浸潤、分化、和成熟受到抑制，同時也可以抑制這些炎癥細胞對腫瘤的殺傷作用[17-18]。TNF-α、IL-2是由T淋巴細胞分泌的、具有免疫調節作用的細胞因子，可反映腫瘤的生長狀況，也能體現腫瘤相關的免疫調節活動水平[19]。IL-2、TNF-α均可以拮抗免疫抑制效應，特定情況下，其可誘導腫瘤細胞凋亡，調控機體免疫反應。

本研究發現，腸癌荷瘤小鼠瘤體質量與瘤體中MDSCs表達具有相關性。擴增和募集的MDSCs促進了腫瘤進展。腸復方、香菇多糖可顯著下調荷瘤小鼠局部腫瘤組織MDSCs細胞增殖，腸復方組優于香菇多糖組，提示腸復方可能從虛濕瘀毒方面改善腫瘤微環境的病理狀態進而抑制MDSCs的擴增。小鼠荷瘤后，外周血中細胞因子表達均顯著提高，證實腫瘤狀態下可刺激細胞因子產生或分化，且小鼠局部瘤體組織中MDSCs細胞與血清IL-10、TGF-β呈正相關，與血清TNF-α呈負相關，提示MDSCs與IL-10、TGF-β等免疫抑制因子具有協同作用，從而促進了腫瘤的發生發展。未發現MDSCs與IL-2有相關性，后續可進一步擴大樣本量繼續探討并深入探究。此外，腸復方可下調血清IL-10、TGF-β的表達，并上調血清IL-2、TNF-α的表達，由此推測，腸復方可增強全身免疫調節，改善全身虛濕瘀毒的內環境，通過調節全身的免疫相關細胞因子可能調控了局部腫瘤組織中MDSCs的募集，從而拮抗結直腸癌的發生發展，有效逆轉腫瘤相關炎癥微環境的免疫抑制狀態。同時也提示，上調TNF-α、IL-2 表達，且下調 MDSCs、TGF-β、IL-10 表達，可能是腸復方發揮免疫調控作用的重要作用機制之一。在本次實驗結果中發現，香菇多糖不僅可以上調IL-2、TNF-α的表達，亦對免疫抑制因子有明顯的抑制作用，可推測香菇對多糖于正向、負向免疫調控方面都具有一定的優勢。

本研究基于中藥方劑的基礎理論，從扶正祛邪兩方面對腸癌免疫微環境進行干預，研究腸復方對腸癌免疫調節機制的影響，結論具有臨床指導意義。但本研究僅探討了MDSCs及細胞因子的表達變化，且未從細胞層面進行功能驗證，后續可進一步完善。