胃癌組織中HIF-1α，CD68及CD206在胃癌及癌旁組織中的表達及臨床意義

周太成，馬寧，黃恩民，馬濤，陳嘉林，陳雙

越來越多研究表明巨噬細胞（Mφ）是腫瘤微環境中最重要的炎性細胞之一，其表面標記物CD68蛋白的高表達與胃癌病人不良預后顯著相關［1］。缺氧是幾乎所有人類實體瘤的典型特征，高增殖的腫瘤細胞比脈管系統發育得更快，因而呈缺氧狀態［2］。其中，低氧誘導分子-1α（HIF-1α）是HIF-1的活性亞基，也是腫瘤組織缺氧的標志物；而缺氧的微環境引起一系列事件發生，包括血管生成、能量代謝改變、免疫破壞、持續增值信號及侵襲轉移等，明顯影響腫瘤患者的預后［7］。同時，作為實體腫瘤微環境（TME）中數量最多的免疫細胞，腫瘤相關巨噬細胞（TAM）優先聚集在腫瘤缺氧區，并主要極化成 M2 型巨噬細胞［8］。而 M2 巨噬細胞可通過增強腫瘤血管生成、組織重塑及轉移促進腫瘤進展［9］。因此，M2 型巨噬細胞表面標記物CD206 的表達高低也影響腫瘤患者的預后狀態。此外，缺氧的腫瘤微環境同時可以招募巨噬細胞，并調節巨噬細胞向 M2 型活化和極化［10，11］。腫瘤干細胞（CSCs）是一種被認為能夠促進腫瘤生長和轉移的細胞亞群，在乳腺癌、胃癌、胰腺癌、結直腸癌等腫瘤中均被發現并起著重要的作用［12］。缺氧和TAM 均可引起腫瘤細胞的干細胞化，對干細胞的自我更新和維持分化扮演者關鍵的角色［13-15］。

本研究初步探討 HIF-1α、CD68、CD206 蛋白表達與胃癌臨床病理相關性，對預測胃癌患者預后，進一步加深對胃癌發生發展的認識有重要價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集 2016 年 1 月-2018 年 1 月在中山大學附屬第六醫院手術切除的胃癌標本，均經術后病理確診。其中，男 33 例，女10 例；年齡 39～78 歲，平均年齡58.8 歲。所有患者術前均未接受放化療治療，取距癌旁3～5 cm 的正常組織作為對照。

1.2 方法

鼠抗人 HIF-1α、CD68、CD206 單克隆抗體均購自廣州佳研生物有限公司。參照抗體說明書步驟檢測三種蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達：恒溫及酒精脫蠟；梯度酒精脫水；抗原修復；山羊血清封閉；封閉一抗二抗；DAB 顯色；蘇木精復染；封片、觀察；以PBS 代替一抗作為陰性對照。

1.3 圖片觀察

免疫組化染色后的切片在正置顯微鏡200 倍下計數5個視野，最終得分=著色強度得分+陽性細胞百分比得分。按下列進行評分：陽性細胞：5%以下計0 分、～25%計1 分、～50%計2 分、～75%以上計3分、＞75%計4分；著色強度：無著色計0分、淺著色計1分、棕黃色計2分、深棕色計3分；陰性≤2分，陽性≥3分；同時記錄每個視野陽性細胞數。

1.4 統計學處理

使用 SPSS 24.0、GraphdPad Prism 8 軟件分析數據，計量資料的比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料的比較采用χ2檢驗，3 種蛋白表達的關聯性采用Spearman 分析，P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 三種蛋白在胃癌和癌旁組織中的表達情況

HIF-1α、CD68 均表達于細胞質，CD206 表達于細胞核和細胞質。HIF-1α在胃癌、癌旁中的陽性率分別是58.1%、18.6%（P＜0.05）；CD68 在胃癌、癌旁中的陽性率分別是69.8%、23.3%（P＜0.05）；CD206在胃癌、癌旁中的陽性率分別是51.2%、9.3%，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖1、表1）。

表1 三種蛋白在胃癌及癌旁組織的表達情況（n）

圖1 HIF-1α、CD68、CD206 在胃癌及癌旁組織中的表達（SP,×200） HIF-1α的表達主要在胃癌細胞，CD68、CD206 主要表達在間質細胞

胃癌、癌旁組織中每個視野下CD68+細胞數分別為（39.7±7.6）、（8.5±2.8）個；CD206 陽性細胞數分別為（32.0±9.2）、（3.4±1.8）個；HIF-1α+細胞數（22.9±5.6）、（2.1±1.2）個；以上組間比較差異均有統計學意義（P＜0.01）（圖2、圖3、圖4）。同時，胃癌組織中CD206+細胞數與HIF-1α+細胞數表達呈正相關（P＜0.01，R2=0.641）（圖5）。

圖2 CD68+細胞在胃癌和癌旁組織中的表達 **P＜0.01

圖3 CD206+細胞在胃癌和癌旁組織中的表達 **P＜0.01

圖4 HIF-1α+細胞在胃癌和癌旁組織中的表達 **P＜0.01

2.2 三種蛋白的表達與臨床因素的關系

三種蛋白在癌組織中的表達與年齡、性別、脈管癌栓無關（P＞0.05），但與胃癌的病理分期、淋巴結轉移相關（P＜0.05）（表2）。

3 討 論

圖5 HIF-1α+與CD206+在胃癌組織中表達的相關性分析

腫瘤微環境在腫瘤的進展和轉移過程中起著重要的作用，導致腫瘤惡性傾向和化療抵抗等行為［3，4］。慢性炎癥有助于癌癥進展，并可能增加不同類型癌癥的易感性［6］。巨噬細胞構成了腫瘤微環境中最主要的炎癥細胞之一，被稱為腫瘤相關巨噬細胞（TAM），分為M1 和M2 型巨噬細胞，M1型巨噬細胞分泌iNOS、TNF 等炎癥因子，促進炎癥發生，防止細菌、病毒、真菌等感染，抑制腫瘤發展；而M2 型分泌IL-10、TGF-β等抗炎因子，參與組織修復、血管生成、腫瘤進展，還可以抑制免疫細胞活性，誘導機體對腫瘤的免疫耐受［1］。在腫瘤微環境中，不同的免疫細胞被癌相關的信號招募且癌細胞和免疫細胞相互影響、促進［7］。

研究證實，腦、胃、乳腺、肝臟、結腸等癌腫內，缺氧影響著患者的生存期［6］。腫瘤缺氧可以通過募集的M2 型TAM 分泌VEGF 等促血管生成因子促進腫瘤新生血管的形成、降解細胞外基質，促進癌細胞的增殖、侵襲和轉移［9］。此外，在應對缺氧時，HIF-1α穩定表達并轉移至細胞核內和HIF-1β形成功能化的異源二聚體，繼而激活胃癌血管生成、侵襲、能量代謝、腫瘤生長及不良預后等一系列基因的表達，HIF-1α是組織缺氧主要標志物［10］。HIF-1α與胃切除術后患者的總生存率和無病生存率密切相關，HIF-1α的高表達被認為是一種有前途的獨立預后生物標志物［11］。同時，缺氧區域的TAM 介導了多種腫瘤的治療抵抗，從而促進癌的復發［12］。

CD68 是一種相對分子質量為110 000 的細胞漿糖蛋白，與溶酶體顆粒有關，主要表達于單核細胞、巨噬細胞，是巨噬細胞最可靠的標志物［13］。文獻報道 CD68+TAM 可以促進前列腺癌［14］、肺癌［15］、腦癌［16］等患者預后。而CD68+TAM 與子宮頸癌［17］、膀胱癌［18］、乳腺癌［19］、胃癌［1］等預后差直接相關。CD206是M2型巨噬細胞的主要標記物之一，CD206的表達高低及數量可以反映巨噬細胞浸潤的數量，與腫瘤惡性程度及預后明顯相關［20］。

表1 三種蛋白在胃癌及癌旁組織的表達情況

本研究通過免疫組化技術測定了胃癌和癌旁組織中的CD68、CD206、HIF-1α的表達，發現均明顯高于癌旁組織，說明胃癌組織存在缺氧狀態、胃癌細胞可釋放活性因子招募單核細胞往腫瘤微環境中浸潤并分化為TAM，形成正反饋。同時，三種蛋白在胃癌中的表達與年齡、性別等因素無關，而與患者的病理分期、淋巴結轉移相關。胃癌組織中CD206+細胞數與HIF-1α+細胞數表達呈正相關，說明胃癌缺氧區域HIF-1α的表達可能對M2 型巨噬細胞有趨化作用或者促進巨噬細胞往M2 型極化，加重惡性循環，促進胃癌發生發展。