Aurora A 激酶抑制劑Alisertib 誘導結直腸癌細胞自噬的作用及與p53表達間的關系

任寶軍，劇永樂，封靜，陳淑香，劉家旋，羅振濤，王家智，楊帆，李德智，董博業，耿巖*

在世界范圍內結直腸癌（CRC）是最常見的惡性腫瘤之一，發病率居第三位，死亡率居第二位［1］，尤其晚期結直腸癌的治療效果不佳，仍缺乏有效的靶向藥物。Alisertib 是第二代Aurora A 激酶（AURKA）抑制劑，研究發現對膠質母細胞瘤、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌等多種腫瘤具有抑制細胞增殖和阻止細胞周期發展的作用［2-4］。但Alisertib對CRC 的誘導細胞自噬的作用尚不清楚。p53 是一種抑癌基因，在CRC 的腫瘤形成機制中發揮重要作用，其與Alisertib 的誘導細胞自噬的作用的關系值得研究。本研究應用Caco-2 和HT29 細胞進行實驗，探討ALS 對不同p53 表達狀態的CRC 細胞的誘導細胞自噬的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Alisertib、SB202190（選擇性p38 MAPK 抑制劑和自噬誘導劑）購自美國Selleckchem公司；Cyto-ID?自噬檢測試劑盒及膜聯蛋白V：藻紅蛋白（PE）凋亡檢測試劑盒購自美國Enzo Life Sciences 公司；p53、p-PI3K（Tyr458）、PI3K、p-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）、p38 MAPK、p-Akt（Ser473）、Akt、LC3-I/II、Western Blotting 底物購自美國Cell Signaling Technology 公司。凝膠成像系統4000R PRO（美國Kodak 公司），流式細胞儀（美國BD 公司），細胞培養箱（美國Thermo Fisher 公司）。

1.2 細胞培養

Caco-2 和HT29 細胞來自美國ATCC。用含10%熱滅活的胎牛血清以及抗生素的DMEM 培養基，于5%CO2、37℃及95%空氣的恒溫細胞培養箱中進行細胞培養。

1.3 流式細胞術檢測細胞自噬率、凋亡率

取對數生長期的Caco-2 和HT29 細胞按密度3×105及6×105個/培養皿接種于60 mm 培養皿，24 h后用 0.1、1、5 μmol/L Alisertib 處理細胞，或先用10 μmol/L SB202190 處理細胞，1 h 后再用 5 μmol/L Alisertib處理細胞。對照組為同濃度的二甲基亞砜（DMSO）。作用24 h 后按照Cyto-ID?自噬檢測試劑盒或膜聯蛋白V：藻紅蛋白（PE）凋亡檢測試劑盒說明書處理細胞，流式細胞儀檢測自噬率、凋亡率。

1.4 Western Blotting 法檢測細胞相關調節蛋白的表達

取對數生長期的Caco-2 和HT29 細胞按密度3×105及6×105個/培養皿接種于60 mm 培養皿，24 h后用0.1、1、5 μmol/L Alisertib 處理細胞，作用 48 h后按照Western Blotting 試劑盒說明書處理。

1.5 統計學方法

以β-actin 作為內參，應用Image Lab 軟件對Wester Blotting 條帶進行灰度值測量，測算各蛋白相對表達水平。余數據用均數±標準差（Mean±SD）表示。多重比較應用Prism 軟件通過單因素方差分析（ANOVA），然后進行Tukey 的多重比較。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Alisertib 誘導了 Caco-2 和 HT29 細胞發生細胞自噬

對照組Caco-2 細胞自噬率為8.1%，實驗組0.1 μmol/L Alisertib組和1 μmol/L Alisertib組細胞自噬率增加，分別為26.4%和26.8%（P＜0.01，圖1）。對照組HT29 細胞自噬率為7.3%，實驗組1 μmol/L Alisertib組和5 μmol/L Alisertib組細胞自噬率增加，分別為36.8%和42.6%（P＜0.01，圖1）。

圖1 ALS 誘導Caco-2 和HT29 細胞發生自噬 將Caco-2 和HT29 細胞暴露于0.1、1 和5 μmol/L ALS 24 h，然后進行流式細胞術分析。流式細胞斑點圖顯示通過Cyto-ID 染色的發生自噬的Caco-2 和HT29 細胞

2.2 Alisertib 調節 Caco-2 和 HT29 細胞中的 PI3K/Akt 和 p38 MAPK 信號通路

與對照組比較，1 μmol/L Alisertib組和5 μmol/L Alisertib 組 Caco-2 細胞的 p-PI3K/PI3K 的比值分別降低為對照組的62.6%和45.2%；0.1 μmol/L Alisertib組、1 μmol/L Alisertib 組和 5 μmol/L Alisertib 組Caco-2 細胞p-Akt/Akt 的比值分別降低為對照組的50.4%、30.1%和38.2%（P＜0.01，圖2）；1 μmol/L Alisertib組和 5 μmol/L Alisertib 組 Caco-2 細胞的 p-p38/p38的比值分別降低為對照組的49.0%和30.4%（圖2）。并且0.1 μmol/L ALS組、1 μmol/L ALS組和5 μmol/L ALS 組 Caco-2 細胞 LC3-Ⅱ/LC3-I 的比值較對照組分別升高67.3%、32.6%和46.8%（P＜0.01，圖2）。

在Caco-2 細胞中p53 蛋白表達缺失（圖3）。而在 HT29 細胞中，1 μmol/L Alisertib 組和 5 μmol/L Alisertib 組p53 蛋白的表達水平升高為對照組的1.4 倍和1.5 倍（P＜0.05，圖3）。

與對照組比較，1 μmol/L Alisertib組和5 μmol/L Alisertib 組HT29細胞的p-PI3K/PI3K的比值分別降低為對照組的70.9%和66.3%（P＜0.001，圖3）；0.1 μmol/L Alisertib 組、1 μmol/L Alisertib 組和5 μmol/L Alisertib 組 HT29 細胞的 p-Akt/Akt 的比值分別降低為對照組的81.4%、85.2%和27.2%（P＜0.01，圖3）；0.1 μmol/L Alisertib組、1 μmol/L Alisertib組和5 μmol/L Alisertib 組 HT29 細胞的 p-p38/p38 的比值較對照組分別升高62.7%、2.1 倍和2.0 倍（P＜0.05，圖3）；1 μmol/L ALS 組和 5 μmol/L ALS 組 HT29 細胞的LC3-Ⅱ/LC3-I 的比值較對照組分別升高78.5%和84.8%（P＜0.01，圖3）。

圖2 ALS 對Caco-2 細胞中自噬通路上關鍵調節蛋白分子的表達水平的影響 ALS 處理Caco-2 細胞后通過Western Blotting 法測定 PI3K、Akt、p38 MAPK 蛋白表達水平及磷酸化水平，以及LC3-I 和LC3-II 的蛋白表達水平，上圖為蛋白表達的代表性印跡條帶

圖3 ALS 對HT29 細胞中自噬通路上關鍵調節蛋白分子的表達水平的影響 ALS 處理HT29 細胞后通過Western Blotting 法測定 PI3K、Akt、p38 MAPK 蛋白表達水平及磷酸化水平，以及LC3-I 和LC3-II 的蛋白表達水平，上圖為蛋白表達的代表性印跡條帶

2.3 在HT29 和Caco-2 細胞中Alisertib 誘導的凋亡和自噬之間存在交互影響

在HT29和Caco-2細胞中，與5 μmol/L Alisertib組比較，10 μmol/L SB202190+5 μmol/L Alisertib 組細胞自噬率升高，分別較5 μmol/L Alisertib 組細胞自噬率升高88.8%和86.6%（P＜0.001）。

在 HT29 細胞中，與 5 μmol/L Alisertib 組比較，10 μmol/L SB202190+5 μmol/L Alisertib 組細胞凋亡率升高64.7%（P＜0.001）。而在Caco-2 細胞中，10 μmol/L SB202190+5 μmol/L Alisertib組較5 μmol/L Alisertib 組的細胞凋亡率無明顯變化。

3 討 論

結直腸癌現有的治療措施包括外科手術、放療、化療等，但晚期結直腸癌患者總體治療效果較差，亟需新的精準的靶向藥物治療。Alisertib（ALS）是選擇性抑制Aurora A 激酶的小分子藥物，對前列腺癌等實體瘤、白血病有很強的抗癌作用［5，6］。ALS是否引起CRC細胞自噬性死亡值得進一步研究。

自噬是一種細胞內的分解代謝的過程。損壞的、功能失調的或過剩的細胞器和蛋白被吞噬、重利用以維持細胞正常的代謝、生存和內穩定［7］。過度自噬可導致細胞死亡。在某些條件下，自噬通過增加程序性細胞死亡來抑制腫瘤形成［8］。有多個通路參與調節細胞自噬，包括正向調節通路（PI3K/Akt 和p38 MAPK 信號通路），發揮抑制自噬的作用，以及負向調節通路（AMPK 和p53 信號通路），發揮促進自噬的作用［9-11］。

本研究顯示實驗組0.1 μmol/L Alisertib 組和1 μmol/L Alisertib 組較對照組Caco-2細胞自噬率增加，分別為26.4%和26.8%，同樣地，實驗組1 μmol/L Alisertib 組和 5 μmol/L Alisertib 組較對照組 HT29細胞自噬率增加，分別為36.8%和42.6%。提示ALS誘導了Caco-2 和HT29 細胞發生自噬。進一步檢測細胞自噬通路上的關鍵蛋白分子的表達情況，發現在分子水平ALS 引起Caco-2 和HT29 和細胞的 p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 比值明顯降低，LC3-II/LC3-I 的比值明顯升高。這些結果表明引起自噬的潛在分子學機制可能為對PI3K/Akt/mTOR 信號的抑制。有趣的是，ALS 對p38 MAPK 信號通路的修飾作用有所不同，引起Caco-2 的p-p38/p38 的比值下降，而HT29 的p-p38/p38 比值升高。這一現象可能與p38 MAPK 有四個不同的亞型有關，包括p38 α、p38 β、p38γ和p38δ。研究顯示在哺乳動物中，其上游調節因子及下游靶點隨著細胞類型及刺激因子的不同而不同［12］。此外，HT29 細胞的p53 基因沒有突變，而Caco-2 細胞的p53 基因有突變，并且不能表達p53 蛋白。這些特征可能引起兩個細胞系的p38 MAPK 信號通路產生不同的變化。其他研究顯示，在胃癌細胞［13］、胰腺癌細胞［3］、骨肉瘤細胞［14］、乳腺癌細胞［15］和卵巢癌細胞［4］中Alisertib 可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR、p38 MAPK或Erk1/2 信號通路而激活AMPK 信號通路促進了細胞自噬。

細胞自噬和凋亡均是高度保守和嚴密調節的細胞過程，通常這兩個生物學過程包含相似的調節通路，甚至共享相同的啟動子和效應子。越來越多的證據表明，自噬和凋亡的交互作用可協同影響以使細胞選擇二者中的某一途徑，決定細胞的命運，以達到內部平衡。我們的研究通過應用SB202190（選擇性p38 MAPK 抑制劑和自噬誘導劑）進行干預，結果表明自噬誘導劑SB202190 在Caco-2 和HT29 細胞中均增強了Alisertib 誘導的細胞自噬，但在HT29 細胞中明顯增強了Alisertib 誘導的細胞凋亡，而在Caco-2 細胞中，細胞凋亡率無明顯變化。這些對細胞自噬和凋亡的差異效應可能取決于細胞類型的差異。由此可以推測，某些重要的調節分子和信號通路協同介導了這一復雜的凋亡和自噬之間的交互作用，包括PI3K/Akt、p38 MAPK 信號通路及p53 是否表達。

綜上所述，Alisertib 誘導了 Caco-2 和 HT29 細胞發生細胞自噬。此過程涉及了多個信號通路的參與，包括 PI3K/Akt、p38 MAPK 信號通路，并可能與p53 蛋白是否表達有關。Alisertib 可能代表了一類新的有潛力的治療CRC 的靶向藥物。