淋巴細胞亞群對乳腺癌新輔助化療療效的預測價值

鐘翠玉，王家維，黃康玲，姚燕丹

乳腺癌是世界范圍內的女性最常見的惡性腫瘤之一［1，2］。對于局部晚期乳腺癌患者，新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）可提高保乳手術成功率，有利于患者的進一步治療［3-6］。一些化療藥物，特別是蒽環類和紫杉類藥物，已顯示出良好的臨床療效，但是并不是所有患者都對化療敏感［4，7，8］。因此，預測 NAC 的療效可以為制定乳腺癌患者的治療方案提供有價值的信息。近年來，越來越多的因素被提出來用于預測患者NAC 的療效［9，10］。一些基本的臨床特征如腫瘤分級和生物學類型是候選的病理完全緩解（pathological complete response，pCR）預測指標［11］。此外，基因表達分析被認為能夠更有效地預測pCR，但由于較高的成本和技術的復雜性，基因檢測可能并不適合臨床應用［12-14］。因此，探索更多可用于預測NAC 療效的因素仍是當務之急。

隨著近年來人們對腫瘤免疫的研究興趣高漲，免疫細胞與化療療效的關系已被深入研究，其中腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrates lymphocytes，TIL）包括細胞毒T 淋巴細胞和自然殺傷（NK）細胞的水平已被證明是預測化療敏感性和生存的重要指標［15-17］。一些研究表明，預先存在的免疫反應可能會增強傳統化療藥物的療效［18，19］。然而，大多數研究集中在腫瘤的原位免疫細胞，但乳腺癌是一種全身性疾病，循環免疫細胞與NAC 預后也可能存在潛在的關系。有報道稱乳腺癌患者的循環T 淋巴細胞可能比正常人減少［20］。另一方面，NK 細胞在先天免疫介導的腫瘤細胞根除中發揮關鍵作用，且在適應性免疫中與T 細胞協同發揮作用［21，22］。一些臨床研究表明，子宮癌和結直腸癌中循環NK 細胞活性水平降低容易導致轉移性播散［23，24］。此外，一些研究人員發現提高外周血NK 細胞水平和維持T 細胞對特定抗原的功能應答可能與乳腺癌患者化療的良好療效有關［25］。這些現象提示外周血淋巴細胞的狀況也可能與NAC的療效密切相關。但NAC 前淋巴細胞亞群狀態與NAC 療效之間的確切關系尚不清楚。本研究的目的是評估外周血淋巴細胞亞群在乳腺癌患者新輔助化療中的潛在預測價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究為回顧性研究，研究對象為2016 年4月至2020 年6 月在中山大學孫逸仙紀念醫院治療的乳腺癌患者，共109 例。納入標準：①粗針穿刺活檢組織學證實為浸潤性癌；②診斷為Ⅱ期Ⅲ期；③化療后手術治療。排除標準：①第二原發癌或雙側乳腺癌患者；②化療后未手術患者。所有患者均接受以紫杉醇和/或蒽環類為基礎的NAC 方案。大約88%的HER2 陽性乳腺癌患者額外使用了曲妥珠單抗。NAC 后患者接受保乳手術、根治性乳房切除術或改良根治術。所有患者術后均接受化療、放療或內分泌治療。本研究的所有參與者均簽署知情同意書，并通過醫院倫理委員會的批準。

1.2 血液樣本分析

在NAC 前或術后采集前臂外周靜脈血液。血液被用來檢測白細胞和淋巴細胞的總數以及淋巴細胞亞群的比例。流式細胞術使用的抗體為BD Multitest 6-color TBNK（Becton-Dickinson，New Jersey，USA）。細胞熒光分析用BD FACS Canto Ⅱ（Becton-Dickinson，New Jersey，USA）按照標準操作進行，數據通過FACS Diva 軟件（version 6.1.3；BD Biosciences，New Jersey，USA）分析。 淋巴細胞亞群鑒定如下：CD3+T 細胞，CD3-CD19+B 細胞，CD3-CD16+CD56+NK 細胞，CD3+CD4+T 細胞，CD3+CD8+T 細胞。

1.3 病理

乳腺癌通過粗針穿刺活檢診斷，并通過計算機斷層掃描（CT）、磁共振成像（MRI）、超聲成像（US）和骨顯像技術進行分期。根據美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer）發表的惡性腫瘤TNM 分類對腫瘤進行分期。當核染色陽性的腫瘤細胞≥1%時，認為雌激素受體（ER）或孕激素受體（PR）陽性。免疫組化染色為3+HER2 的腫瘤定義為 HER2 陽性，2+HER2 的腫瘤通過熒光原位雜交進一步分析。Ki67 增值指數也通過免疫組化評估。根據受試者工作特征曲線分析和約登指數，將Ki67 增殖指數的高、低臨界值定義為62.5%。在4 μm 的乳腺癌組織切片中通過免疫組化法檢測CD3+T 細胞和CD56+NK 細胞。CD3（LN10，NCL-L-CD3-565，QUANHUI IMP& EXP INT’L CO.，LTD，Macau，China）和 CD56（1B6，NCL-L-CD56-1B6，QUANHUI IMP & EXP INT’L CO.，LTD，Macau，China）的免疫組化染色按照說明書的標準程序進行。

用載玻片掃描儀（Mirax Scan；Zeiss，Jena，Germany）對染色載玻片進行全景掃描（放大倍數：200×），從每個染色載玻片中選取五個視野進行評價和評分。CD3+T 細胞或CD56+NK 細胞的密度分為4 類：0，無陽性細胞；1，1%～25%的細胞被染色；2，26%～50%的細胞被染色；3，51%～100%的細胞染色［26］。pCR 是預測 NAC 療效的有效指標之一。pCR 定義為乳腺癌原發灶和腋窩淋巴結標本中均無浸潤性腫瘤細胞殘留。

1.4 隨訪

常規建議患者每3 個月進行一次體檢，每6 個月進行一次US 檢查，每年進行CT 和放射性核素骨顯像檢查。通過查詢醫院病歷系統及電話/短信聯系對入組患者進行隨訪，隨訪時間為從NAC結束起至復發或最后一次隨訪的日期。隨訪內容包括生存狀態、是否復發、是否轉移及具體時間。

1.5 統計學分析

所有的統計分析都使用SPSS 25.0 軟件（IBM，Armonk，NY，USA）進行。采用卡方檢驗分析不同淋巴細胞亞群與pCR 的相關性，以及其它臨床病理變量與pCR 之間的相關性。采用二元logistic回歸模型對pCR 進行多因素分析。通過Kaplan-Meier 檢驗分析不同因素與患者無病生存期（DFS）的關系。當P＜0.05 時，認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 患者的一般資料

共有109 例患者符合標準并納入研究。納入患者的基線特征見表1。這些患者的中位年齡為51歲（范圍：26～69歲），TNM分期的分布如下：Ⅱ期（N=89），Ⅲ期（N=20）。71.6%的患者發生淋巴結轉移。免疫組化結果顯示浸潤性導管癌占92.7%，小葉癌占3.7%，微乳頭狀癌占3.7%。在所有病例中，經粗針穿刺活檢初步診斷為ER、PR 或HER 陽性的乳腺癌分別占69.7%、56.9%和25.7%。

此外，57 例患者接受紫杉醇+蒽環類為主的化療方案（52.3%），52 例患者接受（47.7%）紫杉醇/蒽環類為主的化療方案。19例患者NAC后出現pCR。所有患者化療后3 周內均行手術治療，大部分患者接受改良根治術（54.1%）或保乳手術（37.6%）。

表1 109 例乳腺癌患者的基線特征

2.2 NAC 前淋巴細胞亞群與pCR 的關系

根據ROC 曲線及約登指數，確定白細胞計數、淋巴細胞計數和不同淋巴細胞亞群比例的最佳截點。NAC 前淋巴細胞亞群與pCR 的關系見表2。白細胞數、淋巴細胞計數高的患者pCR 率較高，但差異無統計學意義。在不同淋巴細胞亞群中，T細胞比例＞71.9%（P=0.044）和NK 細胞比例＞36.23%（P=0.049）的患者有較高的pCR 率，且差異具有統計學意義。這表明T 細胞和NK 細胞比例可能對NAC 后的pCR 具有預測價值。此外，CD4+T 細胞比例＞37.05%或CD8+T 細胞比例＞23.55%的患者也表現出較好的病理反應，但差異無統計學意義。

一些研究表明，TIL 與多種腫瘤的預后相關，特別是腫瘤浸潤T 細胞和NK 細胞較多的患者可能預后較好［27-30］。因此，我們進一步研究外周血中T 細胞或NK 細胞比例較高的患者是否腫瘤部位浸潤的T 細胞或NK 細胞也較多。我們在兩組患者中分別隨機選取了幾例患者化療前和化療后的腫瘤組織樣本，通過免疫組化的方法觀察腫瘤部位T 細胞（每組3 例）或NK 細胞（每組2 例）的浸潤情況。如圖1A 所示，我們發現與T 細胞比例低的患者相比，外周血T 細胞比例高的患者NAC 前腫瘤組織有較多的腫瘤浸潤T 細胞。然而，無論外周血中NK 細胞的比例是高是低，NAC 前腫瘤浸潤NK 細胞都非常罕見（圖1B）。這表明外周血T 細胞的比例可能與化療前腫瘤部位T 細胞浸潤的程度有關。此外，與NK 細胞比例低的患者相比，NK 細胞比例高的患者NAC后腫瘤組織中出現更多的腫瘤浸潤性NK 細胞（圖1D-F）。

2.3 多因素分析中T 細胞和NK 細胞比例對pCR的預測價值

對 T 細胞比例、NK 細胞比例、Ki67 增殖指數、臨床病理參數等變量與NAC 后pCR 的相關性進行單因素分析和多因素分析（表3）。在單因素分析中，T 細胞比例（P=0.044）、NK 細胞比例（P=0.049）和Ki67 增殖指數（P=0.010）與pCR 的相關性具有統計學意義。隨后將單因素分析中P＜0.1 的變量納入多因素分析，包括年齡、Ki67 增殖指數、T 細胞比例、NK 細胞比例。結果證實NK 細胞比例（OR：0.101，95%CI：0.014～0.736，P=0.024）和Ki67增殖指數（OR：0.250，95%CI：0.083～0.752，P=0.014）仍然是pCR 的獨立預測因子。

表2 白細胞計數、淋巴細胞計數及不同淋巴細胞亞群與pCR 的相關性

2.4 化療前后T細胞或NK細胞的變化與pCR的關系

在109 例患者中，83 例患者同時接受了化療前和化療后的淋巴細胞亞群檢測。因此，我們進一步分析了這83 例患者NAC 前后T 細胞或NK 細胞比例的變化與pCR 的關系。如表4 所示，NAC后76 例患者的T 細胞比例增加，39 例患者的NK細胞比例增加。化療后NK 細胞比例增加的患者pCR 率較高（P=0.013），差異有統計學意義。大多數患者（91.6%）NAC 后T 細胞比例增加，但T 細胞比例變化與pCR 的關系無統計學意義。

2.5 T 細胞和NK 細胞比例對生存的預測價值

在平均22.37 個月（3.4～50.6 個月）的隨訪中，13 例患者發生了局部復發或遠處轉移，8 例患者死亡，4 例患者失訪，92 例患者在最后一次隨訪時未到達隨訪終點。如圖2 所示，T 細胞或NK 細胞比例較高的患者DFS 較長，但差異無統計學意義。此外，NAC 后NK 細胞增多的患者DFS 較長，但仍無統計學意義。

圖1 部分患者的腫瘤浸潤性T 細胞和NK 細胞 A：CD3 免疫組化染色顯示，T 細胞比例低的患者NAC 前腫瘤浸潤T 細胞少（評分：a：1，b：2，c：3），T 細胞比例高的患者NAC 前腫瘤浸潤T 細胞明顯較多（評分：d：3，e：3，f：2）；B：CD56 免疫組化染色顯示，無論是 NK細胞比例高還是低的患者，NAC 前腫瘤組織幾乎無NK 細胞浸潤（評分：0）；C：顯示圖A 中患者腫瘤部位T 細胞浸潤情況的定量比較，兩者差異有統計學意義。（P=0.011，t 檢驗）；D：外周血NK 細胞比例低的患者的腫瘤浸潤NK 細胞在NAC 前后無明顯差異；E：外周血NK 細胞比例高的患者的腫瘤浸潤NK 細胞在NAC 后（評分：1）較NAC 前（評分：0）增多；F：顯示圖E 中患者腫瘤部位NK 細胞浸潤情況的定量比較，外周血NK 細胞比例高的患者在NAC 后腫瘤浸潤NK 細胞明顯增多

表3 采用單變量和多變量分析方法分析不同因素對pCR 的預測價值

表4 化療前后T 細胞或NK 細胞變化與pCR 的關系

3 討 論

淋巴細胞亞群的狀況已被報道與某些腫瘤新輔助化療的預后有關，但其對乳腺癌新輔助化療的預測價值卻很少被提及［20，31］。本研究主要探討NAC 前不同淋巴細胞亞群比例與NAC 療效的相關性，發現T 細胞或NK 細胞比例高的患者更容易獲得pCR。我們進一步比較了83 例患者在NAC前后的T 細胞和NK 細胞的比例，發現NAC 后NK細胞增加的患者更有可能獲得良好的病理應答，這與以往的研究一致［32］。越來越多的證據表明，一些細胞毒性藥物可以促進特異性的抗癌免疫反應，這有助于提高化療的療效［18，33］。例如，紫杉醇類藥物已經被證明可以增強T 細胞和NK 細胞的功能［18，34］。因此，我們推測 NAC 前較高水平的 T細胞和NK 細胞可能有助于化療過程中誘導抗腫瘤免疫，從而有利于pCR 的誘導。其他幾項研究也證實了T 細胞或NK 細胞與乳腺癌NAC 療效之間的相關性。Muraro 等［32］研究了 78 例乳腺癌患者，證明NAC 期間維持T 細胞對特定抗原的功能應答，提高NK 細胞數量和活性水平可能有助于誘導pCR，特別是對于HER2 陽性乳腺癌患者。另一方面，循環NK 細胞的激活已被證明有助于消除乳腺癌患者的轉移性腫瘤［35］。此外，與之前的研究一致，我們的結果表明，高Ki67 增值指數與高pCR率相關，提示 Ki67 也是 NAC 療效的預測因子［36］。

圖2 不同因素的Kaplan-Meier 曲線 T 細胞比例（A）、NK 細胞比例（B）和NAC 前后NK 細胞比例變化（C）與DFS 的關系無統計學意義

最近的研究表明，TIL 在乳腺癌患者NAC 后的 pCR 中起關鍵作用［17］。Yamaguchi R 等人證明，在高TIL 的病例中，腫瘤浸潤T 細胞較多的患者NAC 后更有可能獲得pCR［28］。大多數腫瘤只有非常低水平的NK細胞浸潤，這與我們的結果是一致的。然而，更多的腫瘤浸潤NK 細胞已被證明與一些腫瘤（如結腸和肺）的更好的預后相關［30，37，38］。Kim R 等發現腫瘤浸潤NK 細胞的存在可能有利于NAC 誘導的乳腺癌患者抗腫瘤免疫［35］。然而，TIL不能代表全身免疫反應，這限制了其在預測系統治療效果方面的應用。有趣的是，我們的研究表明，外周血T 細胞比例較高的患者腫瘤部位也有更多的浸潤性T 細胞。此外，我們觀察到NAC 前外周血NK 細胞比例較高的患者，NAC 后腫瘤部位NK 細胞浸潤增多，這也可能與較好的病理應答有關。這些結果提示外周血T 細胞或NK 細胞比例較高的患者，其腫瘤浸潤性T 細胞或NK 細胞可能也相應較多。根據這些結果，我們推測系統免疫反應與局部免疫反應密切相關，并與局部免疫反應協同作用發揮抗腫瘤功能，這有待進一步研究。因此，治療前外周血T 細胞或NK 細胞比例較高，提示機體免疫具有較高的抗癌潛力，這可能預示著較好的NAC 療效。

此外，我們還分析了外周血T 細胞和NK 細胞對DFS 的預測價值。結果顯示，T 細胞和NK 細胞比例較高的患者DFS 較長，但差異無統計學意義。雖然所有結果均無統計學意義，但仍不能認為T 細胞或NK 細胞比例與DFS 沒有相關性，因為很多患者隨訪時間較短，沒有達到終點。此外，本研究也有一些其他的局限性。由于本研究為回顧性分析，某些參數的記錄不可避免地不完整。因此，我們需要嚴謹的前瞻性研究來進一步證實和擴展我們的發現。

本研究提示NAC 前T 細胞和NK 細胞的高比例是pCR 的重要預測因子，這可能與化療誘導的抗腫瘤免疫有關。另外，化療后NK 細胞比例的增加也表明更有機會獲得pCR。該指標可以從血液中獲得，不需要任何特殊設備或侵入性程序，比現有的一些指標更容易檢測。本研究結果可能為癌癥治療提供新的思路，但需要進一步的前瞻性研究來證實這一點。