8-Nitroguanine在肝吸蟲相關(guān)性肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá)以及意義

林杰，劉清波，何威，馬靖，陳韻壕，王衛(wèi)東

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是第二位原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，占原發(fā)性肝癌的10%～20%，其發(fā)病率和死亡率近年來呈上升趨勢(shì)［1］。ICC 發(fā)生隱匿、早期診斷困難、惡性程度高、發(fā)展迅速、等臨床特點(diǎn)，臨床總體預(yù)后較差［2］。外科手術(shù)是ICC 目前有效的首選的治療方法，但手術(shù)切除率低，術(shù)后易復(fù)發(fā)，術(shù)后5 年總生存率僅為30%左右［3］。ICC 發(fā)生主要與肝吸蟲感染、肝內(nèi)膽管結(jié)石、硬化性膽管炎以及病毒性肝炎有密切的關(guān)系。8-Nitroguanine 是細(xì)胞炎癥反應(yīng)中由活性氮族攻擊核酸的產(chǎn)物，其在麝貓后睪吸蟲（opisthorchis viverrini，OV）感染的動(dòng)物肝臟中有較強(qiáng)表達(dá)［4］，目前被認(rèn)為是一種潛在炎癥相關(guān)性癌變標(biāo)志物［5］。本實(shí)驗(yàn)研究 8-Nitroguanine 在伴有華支睪吸蟲感染的ICC 患者病理組織以及血清表達(dá)的情況，初步探討8-Nitroguanine 與華支睪吸蟲感染相關(guān)性ICC 的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明ICC 發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

組織標(biāo)本以及血清取自南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院肝膽胰脾外科2016 年1 月至2018 年6 月行根治性切除的伴有肝吸蟲感染的ICC 患者，包括：①術(shù)前有大便肝吸蟲卵陽性或影像學(xué)證明有肝吸蟲感染或術(shù)中、術(shù)后病理表標(biāo)本見有肝吸蟲蟲體（或肝吸蟲蟲卵）；②術(shù)后病理學(xué)證實(shí)為肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌；③排除伴隨病毒肝炎感染、肝膽管結(jié)石、硬化性膽管炎或先天性肝內(nèi)膽管擴(kuò)張癥（Caroli 病）的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者；④經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)以及患者知情同意。患者總共18 例，其中男性16 例，女性 12 例，年齡 45～65 歲，平均年齡 50 歲。所有患者術(shù)前均未接受放、化療，組織標(biāo)本均在手術(shù)切除后15 min 內(nèi)采集行新鮮標(biāo)本置于-80℃冰箱和石蠟片固定保存。

18 例肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌血清標(biāo)本手術(shù)前一天采集，另外同時(shí)取自知情同意的18 例住院治療的肝吸蟲性膽管炎患者及18 例體檢的健康志愿者。血清標(biāo)本在離心分離后，置于-80℃保存。

1.2 試劑以及主要儀器

8-Nitroguanine 購自 Kamiya 公司；Abcam 抗體購自 Abcam 公司，Qproteome FFPE Tissue 試劑盒購自 QIAGENE 公司，ELISA 試劑盒（STA-825）購自Cell Biolabs 公司；DMSO 購自上海試一化學(xué)試劑公司；胎牛血清（PBS）購自 FBS Ausbian 公司；6 孔板、96 孔板購 Corning 公司；M2009PR 型號(hào)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購自Tecan infinite 公司。

1.3 石蠟標(biāo)本的組織總蛋白的提取

取ICC 患者腫瘤組織、癌旁組織和正常肝組織石蠟標(biāo)本樣品放入EP 管中，二甲苯室溫浸泡10 min，1000 rpm 2 min 離心去上清，重復(fù)一次；無水乙醇室溫浸泡10 min，1000 rpm 2 min 離心去上清，重復(fù)一次；95%乙醇室溫浸泡10 min，1000 rpm 2 min 離心去上清，重復(fù)一次；70%乙醇室溫浸泡10 min，1000 rpm 2 min 離心去上清，重復(fù)一次；將EXB 緩沖液加入β-巰基乙醇，配成工作液；每管加入80 μL EXB 工作液，渦旋振蕩，冰上5 min，100 ℃20 min，80 ℃ 2 h，馬上放到冰上 1 min，14 000 g 15 min 4℃離心，取上清，用于ELISA檢測(cè)。

1.4 ELISA 檢測(cè) 8-Nitroguanine 表達(dá)

取肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌、肝吸蟲性膽管炎及健康志愿者血清50 μL 于96 孔板，向每個(gè)孔中加入用PBS 按 1∶400 稀釋的 8-Nitroguanine 共軛物孵育 4℃過夜；倒掉液體，用200 μL PBS 洗一次；加入200 μL Assay 稀釋液，孵育2 h；制作濃度的標(biāo)曲，每孔加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品50 μL、室溫孵育10 min；每孔加入 50 μL 用 Assay 稀釋液按 1∶2000 稀釋的 Anti-8-Nitroguanine 抗體；用封口膜封住微孔板，搖床上室溫孵育1 h；倒掉孔內(nèi)液體，加入250 μL 1×洗滌緩沖液，30 s 后倒干凈液體，重復(fù)5 次；每孔加入100 μL 用 Assay 稀釋液按 1∶1000 稀釋的二抗；用封口膜封住微孔板，搖床上室溫孵育1 h；倒掉孔內(nèi)液體，加入 250 μL 1×洗滌緩沖液，30 s 后倒干凈液體，重復(fù) 5 次；每孔加入 100 μL 基質(zhì)溶液，避光孵育 2 ～ 30 min；每孔加入100 μL 終止液；用酶標(biāo)儀讀取450 nm 下的OD 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清8-Nitroguanine 含量。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

RBE 細(xì)胞按106/孔接種于6 孔板，使用含10%胎牛血清DMEM 高糖培養(yǎng)基，置于含5%CO2，37℃飽和濕度環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

RBE 細(xì)胞按 2000/孔接種于 96 孔板，設(shè)置 6 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)分為藥物組和溶劑組，8-Nitroguanine 溶解于DMEM 培養(yǎng)基，藥物組以梯度濃度（0.0、0.1、0.5、1、2、4、8、16、24、32、48、64、128、256 nM）8-Nitroguanine 溶液處理細(xì)胞，溶劑組以等量溶劑處理細(xì)胞。24 h 后每孔加入20 μL MTT 工作液（5 g/L），繼續(xù)37℃孵育2 h。棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）200 μL，置平板搖床震蕩至結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 波長(zhǎng)各孔的吸光度（OD）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值計(jì)算不同濃度的8-Nitroguanine 對(duì)細(xì)胞增殖抑制率，并根據(jù)濃度反應(yīng)曲線擬合計(jì)算半抑制濃度（IC50）。

1.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

提前以50 μL 10% Matrigel 基質(zhì)膠包被Transwell 小室，以濃度為 IC50 值的 8-Nitroguanine 溶液處理RBE 細(xì)胞24 h 后，無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以5×104/孔接種于Transwell 上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，結(jié)晶紫染色著色25 min，取出小室，用棉簽輕柔拭去小室內(nèi)側(cè)膜細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選擇5 個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算各組細(xì)胞的侵襲率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)描述以表示，兩組計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料的比較采用方差分析檢驗(yàn)，兩兩比較用Dunnett"s 法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05（雙側(cè)）。

2 結(jié) 果

2.1 8-Nitroguanine 在ICC 患者臨床病理標(biāo)本表達(dá)情況

ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，8-Nitroguanine在ICC癌患者腫瘤組織中表達(dá)量顯著（199.63±35.15）ng/mL，明顯高于癌旁組織（43.02±10.43）ng/mL 和正常肝組織（41.10±11.24）ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。而后兩者中8-Nitroguanine 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.9518）。

圖1 8-Nitroguanine 在ICC 患者病理組織中表達(dá) ***表示P＜0.001，n.s 表示P＞0.05

2.2 8-Nitroguanine 在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者術(shù)前血清中表達(dá)

ELISA 法檢測(cè)結(jié)果顯示（圖2），健康正常人、肝吸蟲性膽管炎患者以及ICC 患者三者進(jìn)入血液中 8-Nitroguanine 值分別為（331.17±61.71）ng/mL 和（346.075±85.22）ng/mL 和（325.36±77.79），三種差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.6994）。

圖2 8-Nitroguanine在各種人群血清中表達(dá) n.s表示P＞0.05

2.3 8-Nitroguanine 對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖能力的影響

劑量反應(yīng)曲線顯示（圖3），8-Nitroguanine 對(duì)RBE 細(xì)胞的增殖能力具有抑制作用，該作用呈濃度依賴性，曲線擬合計(jì)算得出IC50 值約為128nm。

圖3 8-Nitroguanine 對(duì)膽管癌細(xì)胞RBE 增殖能力的影響

2.4 8-Nitroguanine 對(duì)膽管癌細(xì)胞侵襲能力的影響

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示（圖4），藥物組和溶劑組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（188±21）個(gè)和（179±3）個(gè)，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.70）。說明8-Nitroguanine對(duì)膽管癌細(xì)胞的侵襲能力無明顯作用。

3 討 論

圖4 8-Nitroguanine 對(duì)膽管癌細(xì)胞RBE 增殖能力的影響 n.s 表示P＞0.05

肝吸蟲感染與ICC 關(guān)系密切，被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）列為Ⅰ類致癌因子［6］。肝吸蟲寄生在肝膽管，其機(jī)械性刺激和蟲體代謝產(chǎn)物的作用主要造成局部急性或慢性炎癥，引起膽管上皮損傷，誘發(fā)炎癥相關(guān)性疾病。肝吸蟲誘發(fā)肝內(nèi)膽管癌是一個(gè)復(fù)雜的慢性、長(zhǎng)期過程，但其具體機(jī)制不清。肝吸蟲主要分為華支睪吸蟲（Clonorchis sinensis）和麝貓后睪吸蟲（Viisthorchis viverrini），兩者分布上略有不同，前者主要分布于中國(guó)、韓國(guó)和越南的部分區(qū)域，而麝貓后睪吸蟲主要分布在東南亞國(guó)家，如泰國(guó)、老撾、越南和柬埔寨。相對(duì)而言，目前對(duì)麝貓后睪吸蟲導(dǎo)致膽管癌的研究更為深入。Pinlaor S 等研究表明了麝貓后睪吸蟲（opisthorchis viverrini，OV）誘發(fā)肝內(nèi)膽管癌的機(jī)制可能在OV 抗原可能通過Toll 受體介導(dǎo)通道引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和環(huán)氧合酶-2（Cyclooxygenase 2，COX-2）的表達(dá)以及核因子kB（nuclear factor-κB，NF-kB）的激活，從而導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞癌變［7，8］。而本研究將探究8-Nitroguanine 對(duì)華支睪吸蟲相關(guān)性ICC 的致病作用，進(jìn)一步闡明華支睪吸蟲感染和ICC 的關(guān)系。

大約25%癌癥病例由慢性炎癥引起［9］。慢性炎癥反復(fù)刺激，炎癥細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生活性氧物質(zhì)（Reactive oxygen species，ROS）和活性氮物質(zhì)（Reactive nitrogen species，RNS），損傷細(xì)胞各種成分，比如核酸、蛋白、脂質(zhì)等。8-Nitroguanine 是一種致突變DNA 損傷物質(zhì)，主要在活性氮物質(zhì)反應(yīng)中由細(xì)胞表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）催化細(xì)胞內(nèi)大量合成一氧化氮（Nitric oxide，NO）導(dǎo)致細(xì)胞 DNA 鳥嘌呤硝基化的產(chǎn)物［10］。8-Nitroguanine 具有潛在致突變性，可誘導(dǎo)DNA G：C 突變至T：A，誘發(fā) DNA 損傷并導(dǎo)致癌變［11］。Hiraku Y 等［12］研究發(fā)現(xiàn)在OV 感染的急性期，8-Nitroguanine 在炎性細(xì)胞內(nèi)明顯增加，而在慢性感染期，這種DNA 損傷出現(xiàn)在膽管上皮細(xì)胞內(nèi)，重復(fù)感染增加了8-Nitroguanine在膽管上皮細(xì)胞內(nèi)形成，而用吡喹酮治療明顯減少8-Nitroguanine 生產(chǎn)。該研究組用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)在OV 感染的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的臨床病理標(biāo)本中，8-Nitroguanine 在癌組織累積比正常組織明顯增強(qiáng)［13］。另外，8-Nitroguanine 這種 DNA 損傷累積在與癌癥相關(guān)病人體中發(fā)現(xiàn)，比如幽門螺桿菌、慢性丙型肝炎、人乳頭狀瘤病毒、EB 病毒等［5］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在伴有華支睪吸蟲感染的ICC 癌組織中8-Nitroguanin 的濃度明顯高于正常肝組織和癌旁組織，而正常肝組織和癌旁組織中8-Nitroguanin 的濃度無明顯差異，提示8-Nitroguanin 可能在華支睪吸蟲相關(guān)性ICC 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。8-Nitroguanine 的在DNA 以及RNA形成上不穩(wěn)定，能自動(dòng)釋放，在血液中也能檢測(cè)到［10］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在健康正常人、華支睪吸蟲性膽管炎患者以及ICC 患者血清中均能檢測(cè)到8-Nitroguanin，但血清中8-Nitroguanin 的濃度在ICC無明顯升高，提示8-Nitroguanin 的致癌作用與其形成局部炎癥反應(yīng)有關(guān)，這與Pinlaor S 等研究推測(cè)相一致［13］。

DNA 損傷會(huì)觸發(fā)細(xì)胞的自我清除機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死，其帶來的大量基因組突變也會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)［14，15］。本研究細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)表明，8-Nitroguanin 作為一種DNA 損傷誘導(dǎo)物質(zhì)，能夠顯著抑制膽管癌細(xì)胞的增殖特性，但細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，8-Nitroguanin 并未對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲特性產(chǎn)生任何影響，說明8-Nitroguanin 對(duì)ICC的致病作用主要體現(xiàn)在誘導(dǎo)DNA 損傷并觸發(fā)癌變，而在癌變后腫瘤細(xì)胞惡性特征并無維持作用。

綜上所示，肝吸蟲感染誘導(dǎo)肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌發(fā)生可能是由于肝吸蟲感染后導(dǎo)致肝膽管反復(fù)急慢性炎癥，炎癥不斷刺激炎性細(xì)胞以及膽管上皮細(xì)胞產(chǎn)生8-Nitroguanine，并在局部積累，誘導(dǎo)細(xì)胞DNA 突變從而導(dǎo)致肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。