轉(zhuǎn)錄因子YY1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)和功能研究

黃貽培 ，羅偉鑫 ，許磊波 *

肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是肝臟最常見(jiàn)的原發(fā)惡性腫瘤，具有起病隱匿及容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，往往預(yù)后不良［1-3］。目前根治性手術(shù)及手術(shù)替代方案（如靶向治療）均有較大的缺陷和不確定性。弄清HCC 發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍然是科研人員不斷追求的目標(biāo)。Yin Yang 1（YY1）是一類含有C2H2 型鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，屬于GL1-Kruppel 蛋白質(zhì)家族，通過(guò)不同的活性區(qū)域與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，參與調(diào)控細(xì)胞干性、分化以及細(xì)胞復(fù)制、增殖等生物學(xué)過(guò)程［4-6］。近來(lái)的研究顯示，YY1 可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，在乳腺癌、胰腺導(dǎo)管腺癌及食管鱗狀細(xì)胞癌起抑癌基因的作用［7-11］；與此相反，在肺癌、胃癌及結(jié)直腸癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中則發(fā)揮原癌基因的作用［11-13］，表明YY1 在腫瘤進(jìn)展中功能的發(fā)揮具有背景依賴性。YY1 在肝癌中的作用尚存在爭(zhēng)議，Kim JS 等學(xué)者報(bào)道YY1 分布在肝癌細(xì)胞核及細(xì)胞漿中，細(xì)胞核中YY1 高表達(dá)的肝癌患者腫瘤分期更晚，且多合并血管侵犯，患者的生存預(yù)后更差，表明YY1在肝癌中發(fā)揮促癌作用［14］；而Wang LM 等的研究則顯示，YY1 在肝癌組織中低表達(dá)，并于體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制YY1 表達(dá)后肝癌細(xì)胞凋亡減少、侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)，表明YY1在肝癌的進(jìn)展中發(fā)揮抑癌基因作用［15］。因此，YY1 在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用亟待更多臨床樣本驗(yàn)證及深入的分子生物學(xué)機(jī)制研究。本研究通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)及臨床組織樣本分析YY1 在肝癌中的預(yù)后意義，同時(shí)探討YY1 對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞體外增殖、遷移及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 肝癌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)

從腫瘤基因組圖譜計(jì)劃（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中查找并下載肝癌的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)TCGA-LIHC 及相關(guān)臨床參數(shù)進(jìn)行分析，得到374 例肝癌及配對(duì)的50 例癌旁組織的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。同時(shí)從美國(guó)國(guó)家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）創(chuàng)建的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）和國(guó)際癌癥基因組聯(lián)盟數(shù)據(jù)庫(kù)（The International Cancer Genome Consortium，ICGC）中下載肝癌mRNA 片數(shù)據(jù)作為驗(yàn)證隊(duì)列，獲取GSE14520、GSE25097 及LIRI-JP 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。其中GSE14520 有225 例肝癌及220 例配對(duì)癌旁組織的mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)；GSE25097 有 6 例正常肝組織，40 例肝硬化組織，268 例肝癌及243 例配對(duì)癌旁組織的 mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)；LIRI-JP 包括有 243 例肝癌及配對(duì)的202 例癌旁組織的mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2 肝癌組織樣本

本研究經(jīng)中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得受試者的知情同意。本研究采用自 2019 年 9 月～2019 年 12 月在中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院行手術(shù)切除治療的30 對(duì)肝癌組織及配對(duì)的正常肝組織標(biāo)本，經(jīng)10%福爾馬林溶液固定后用石蠟包埋長(zhǎng)期保存，并制成4 μm 厚組織切片行免疫組化染色，所有患者術(shù)后病理學(xué)報(bào)告證實(shí)為肝細(xì)胞癌。

1.3 肝癌細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞系 Huh7、PLC/PRF/5、HepG2 和Hep3B 購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection，ATCC），正常肝細(xì)胞系L02、肝癌細(xì)胞系 BEL-7402、MHCC97H、HCCLM3 均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，在含有10%胎牛血清（Gibco，USA）的DMEM（BI，Israel）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，常規(guī)添加100 μg/mL 鏈霉素及100 U/mL青霉素（BI，Israel），于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

YY1 和GAPDH 兔抗人單克隆抗體分別購(gòu)自美國(guó) Abcam 和 Cell Signaling Technology 公司；免疫組化試劑盒（Dako，Denmark）；BCA 蛋白定量試劑盒（Invitrogen，USA）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及TB Green染料法標(biāo)準(zhǔn)型定量試劑盒（Takara，Japan）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）檢測(cè)試劑盒（Yeasen，China）；Edu 檢測(cè)試劑盒（Beyotime，China）8 μm 孔徑的 Transwell 小室及 Matrigel 購(gòu)自美國(guó) Corning 公司 ；YY1 及 GAPDH 引 物 序 列 為 ：GAPDH-F：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT；GAPDH-R：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG；YY1-F：AAGAGCGGCAAGAAGAGTTAC；YY1-R：CAACCACTGTCTCATGGTCAATA。

1.5 免疫組化

肝癌組織石蠟切片經(jīng)60℃烘烤2 h，趁熱置于二甲苯中10 min 進(jìn)行脫蠟處理，使用不同濃度梯度的酒精（無(wú)水酒精，95%，80%，75%）行水化處理，經(jīng)0.3%的過(guò)氧化氫處理10 min 去除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶后，使用Tris-HCl（pH=9.2）抗原修復(fù)液于高壓鍋中修復(fù)10 min，YY1 抗體按1∶1 000 濃度4℃于濕盒孵育過(guò)夜。次日PBS 洗去一抗，37℃溫箱孵育二抗30 min，DAB（DAKO，Denmark）顯色后用蘇木素進(jìn)行細(xì)胞核染色。根據(jù)染色強(qiáng)度，將YY1組織染色強(qiáng)度評(píng)分分為：0=無(wú)染色，1=染色弱，2=染色中等，3=染色強(qiáng)，染色范圍按百分比計(jì)算（0～100）。強(qiáng)度評(píng)分乘以染色范圍即為YY1 的染色評(píng)分。

1.6 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS 洗去培養(yǎng)基，甩干后加入預(yù)先配好的細(xì)胞裂解液（RIPA裂解液+1∶100 蛋白酶抑制劑+1∶100 磷酸酶抑制劑，均購(gòu)自中國(guó)康為世紀(jì)公司），冰上裂解15 min，15 000 rpm 離心20 min 后取上清經(jīng)BCA 法測(cè)定蛋白濃度。按細(xì)胞總蛋白量20 μg 進(jìn)行上樣，經(jīng)10%的SDS-PAGE 進(jìn)行蛋白電泳，然后經(jīng)電轉(zhuǎn)至PVDF膜（Millipore，USA）上。加入一抗（YY1 與GAPDH均按照1∶1000 稀釋使用）后置于4℃冰箱過(guò)夜孵育，次日TBST 洗去一抗后，抗兔二抗（Cell Signaling Technology，USA）室溫孵育1 h。BCL 超敏發(fā)光液（Millipore，USA）曝光并拍攝。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按照試劑說(shuō)明書使用RNAiso Plus（Invitrogen，USA）提取細(xì)胞RNA，采用PrimerScript RT Master Mix 試劑盒（Takara，Japan）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)驗(yàn)按照TB Green Premix Ex Taq 試劑盒說(shuō)明書（Takara，Japan）進(jìn)行，操作儀器為Roche LightCycler 480Ⅱ。PCR 實(shí)驗(yàn)以 GAPDH 作為內(nèi)源性對(duì)照，每個(gè)反應(yīng)的溶解曲線只有一個(gè)峰才可視為有效結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化及離心后，用完全培養(yǎng)基重懸成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后將細(xì)胞接種至96 孔板，密度為1000 個(gè)/孔，每孔完全培養(yǎng)基為100 μL。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，沿孔壁緩慢加入10 μL CCK-8 試劑，輕微搖勻后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待孵育1 h 后使用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)每個(gè)孔的吸光值。同樣的方法檢測(cè)第24 h、48 h、72 h、96 h 的吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.9 Edu 法檢測(cè)細(xì)胞增殖

按3000 個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于96 孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。按照試劑盒說(shuō)明書加入預(yù)先配置好的1X Edu 溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，棄去Edu 溶液，4%多聚甲醛固定15 min，用0.3%TritonX-100/PBS 溶液室溫孵育15 min 進(jìn)行膜通透處理，用Hoechst 給細(xì)胞核染色后于熒光顯微鏡下拍照保存、計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.10 克隆形成實(shí)驗(yàn)

按每孔1000 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，混勻后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱溫度保持37℃，二氧化碳體積濃度比維持5%，每2～3 d 給細(xì)胞換液。待細(xì)胞長(zhǎng)出明顯的單細(xì)胞克隆后，吸去孔中培養(yǎng)基，PBS 清洗后加入4%多聚甲醛固定15 min，加入0.1%結(jié)晶紫溶液給細(xì)胞染色30 min，用ddH2O 洗去殘留的結(jié)晶紫溶液，晾干后拍照、計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.11 Transwell 細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)

基質(zhì)膠提前一晚放于冰上化凍，用預(yù)冷的無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基按1∶3 的比例稀釋基質(zhì)膠，將80 μL 稀釋后的凝膠滴入 8 μm 孔徑的 Transwell 小室上室面，使凝膠鋪勻后，室溫靜置2 min 后吸去60 μL，上室面留下 20 μL 稀釋后的基質(zhì)膠，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱2 h 待其凝固備用。將細(xì)胞消化離心，用PBS 洗去殘留的培養(yǎng)基，再次離心后用無(wú)血清的DMEM 重懸計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，分別取 200 μL 加入上室，下室加入 700 μL 含 10%血清的DMEM 完全培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室，棄去上室中培養(yǎng)液，PBS 清洗后置于4%多聚甲醛中固定15 min，PBS 清洗后置于0.1%濃度的結(jié)晶紫中染色30 min，ddH2O洗去結(jié)晶紫，晾干后于顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)不鋪基質(zhì)膠，上室加入100 μL 細(xì)胞懸液，余實(shí)驗(yàn)步驟相同。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.12 基因集富集分析

將TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的肝癌mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)根據(jù)YY1 表達(dá)高低進(jìn)行分組，YY1 表達(dá)高于總體75%者歸于YY1 高表達(dá)組，表達(dá)低于總體25%者歸于YY1低表達(dá)組，兩組間的基因表達(dá)矩陣用于基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）［16］，選用c2.cp.kegg.v6.0.symbols.gmt 作為預(yù)定義基因集，分析與YY1 表達(dá)最相關(guān)的生物過(guò)程及信號(hào)通路。

1.13 基因富集分析

利用R 軟件包“clusterProfiler”對(duì)篩選出來(lái)的93 個(gè)YY1 共表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 富集分析和GO富集分析［17］，分析共表達(dá)基因的生物學(xué)功能。繪制柱狀圖：橫坐標(biāo)為基因數(shù)，縱坐標(biāo)為各信號(hào)通路，柱狀圖顏色代表p 值。

1.14 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）對(duì)93個(gè)YY1 共表達(dá)基因構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein -protein interaction network，PPI）［18］，置信度設(shè)置為0.7（高度可信），所得結(jié)果用Cytoscape 軟件行可視化分析。

1.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究采用GraphPad Prism 8.0 及R 3.6.1 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。生存分析使用Kaplan-Meier法。體外細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示為3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。兩樣本之間比較，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊采用Studentt 檢驗(yàn)；方差不齊的數(shù)據(jù)采用校正t檢驗(yàn)。P＜0.05 時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 YY1 在肝癌中表達(dá)上調(diào)且與不良預(yù)后相關(guān)

在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的肝癌隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)，YY1 在肝癌中表達(dá)量顯著上調(diào)（圖1A），高表達(dá)YY1 的患者總體生存期（overall survival，OS）較短（圖1B）。其中，低表達(dá)YY1 的肝癌患者中位生存期為5.84 年，而高表達(dá)YY1 的肝癌患者中位生存期僅為3.14年。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在腫瘤體積分期為T3 及T4的患者中YY1 表達(dá)更高（10.36±3.64 vs 9.04±2.75，P＜0.01，圖1C）；腫瘤分期越晚（Ⅲ+Ⅳ）、組織學(xué)分化更差（Ⅲ+Ⅳ）的患者中YY1 表達(dá)顯著增加（圖1D-1E，P＜0.05），提示YY1 表達(dá)可能與肝癌增殖、惡性進(jìn)展相關(guān)。在GSE14520、GSE25097 及ICGCLIRI-JP 肝癌驗(yàn)證隊(duì)列中，我們發(fā)現(xiàn)YY1 在肝癌組織中表達(dá)量顯著高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001，圖1F～1H）

2.2 YY1 在肝癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)情況

分析我院30 對(duì)肝癌及配對(duì)癌旁組織的YY1免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，YY1 集中表達(dá)在細(xì)胞核中，相比于癌旁組織，YY1 在肝癌組織內(nèi)陽(yáng)性區(qū)域更多、染色更強(qiáng)（圖2A），肝癌組織的免疫評(píng)分顯著高于癌旁組織（P＜0.05，圖2B）。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)YY1 在BEL-7402、HepG2、Hep3B、Huh7、MHCC97H、HCCLM3 等肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)，在PLC/PRF/5 中低表達(dá)（圖2C）。因此，我們使用敲降表達(dá)及過(guò)表達(dá)YY1 的慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞株；其中，肝癌細(xì)胞Huh7 敲降 YY1 表達(dá)，低表達(dá) YY1 的 PLC/PRF/5 細(xì)胞則過(guò)表達(dá) YY1。如圖 2D 中顯示，Huh7 敲低 YY1 表達(dá)后，蛋白水平明顯下降；PLC/PRF/5 經(jīng)過(guò)表達(dá)YY1后，蛋白水平也明顯增加。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在Huh7 中敲低YY1 表達(dá)后mRNA 水平明顯下降（P＜0.05，圖 2E）；PLC/PRF/5 中過(guò)表達(dá)YY1 組較對(duì)照組mRNA 的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05，圖2F）。

2.3 YY1 對(duì)肝癌細(xì)胞體外增殖功能的影響

在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)肝癌研究隊(duì)列中，YY1 的表達(dá)與患者腫瘤大小顯著相關(guān)（圖1C）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，YY1 的表達(dá)水平與常見(jiàn)的增殖相關(guān)基因MKI67、PCNA 及MCM2 表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（Spearman相關(guān)系數(shù)分別為：Ki67：R=0.46，P＜0.0001；PCNA：R=0.44，P＜0.0001；MCM2：R=0.46，P＜0.0001；圖3A-3C）。體外CCK-8 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示，在Huh7 中干擾YY1 表達(dá)后，細(xì)胞增殖減慢，在第 96 h 的 OD450 顯著低于對(duì)照組（1.040±0.092vs1.447±0.099，P＜0.01，圖 3D）；PLC/PRF/5 過(guò)表達(dá)YY1 后細(xì)胞增殖顯著加快，PLC/PRF/5-YY1 在第96 h 的吸光值顯著高于對(duì)照組（1.266±0.053vs0.963±0.041，P＜0.001，圖3F）。在 Edu 增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，Huh7-shYY1 組較對(duì)照Huh7-shCon 組Edu 陽(yáng)性的細(xì)胞比例明顯減少（P＜0.001，圖3E），提示細(xì)胞增殖比例下降；在PLC/PRF/5-YY1 相比于對(duì)照組細(xì)胞，Edu 陽(yáng)性細(xì)胞占比則有所增加（P＜0.01，圖3G）。克隆形成實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Huh7 干擾YY1 表達(dá)后，其克隆形成數(shù)目（392±55.6）少于對(duì)照組（151.3±66.9），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖3H）。而過(guò)表達(dá)YY1 的PLC/PRF/5 細(xì)胞克隆形成數(shù)目（446.7±39.5）顯著多于對(duì)照組（306±41，P＜0.05，圖3I）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示YY1 可影響肝癌細(xì)胞的增殖能力，提示YY1 可能在促進(jìn)肝癌增殖、生長(zhǎng)中發(fā)揮了重要的作用。

圖1 YY1 在肝癌組織中的表達(dá)情況圖 A：YY1 在TCGA-LIHC 中的表達(dá)情況（t 檢驗(yàn)）；B：TCGA-LIHC 中YY1 表達(dá)與患者總體生存期相關(guān)（Kaplan-Meier 法，log-rank 檢驗(yàn)）；C、D、E：YY1 在TCGA-LIHC 中與腫瘤體積、腫瘤分期、病理學(xué)分級(jí)相關(guān)（t 檢驗(yàn)）；F：YY1 在GSE14520 中的表達(dá)情況（t 檢驗(yàn)）；G：YY1 在GSE25097 中的表達(dá)情況（t 檢驗(yàn)）；H：YY1 在ICGC-LIRI-JP 中的表達(dá)情況（t 檢驗(yàn)）

2.4 YY1 對(duì)肝癌細(xì)胞體外遷移侵襲能力的影響

Transwell 細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，Huh7 干擾YY1 表達(dá)后，Huh7-shYY1 組 24 h 的細(xì)胞遷移數(shù)（62.7±11.7）較對(duì)照組（118.3±7.6）明顯減少；侵襲細(xì)胞數(shù) Huh7-shYY1 組為 49±2，對(duì)照組為 100.7±10.5，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖 4A）。過(guò)表達(dá) YY1 的 PLC/PRF/5 細(xì)胞中，24 h 遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組均明顯增加（遷移細(xì)胞數(shù)：220.7±14.3vs59.7±13；侵襲細(xì)胞數(shù)：176.3±15.5vs38±8），兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4B）。因此，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)YY1 可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

2.5 YY1 與基因集富集分析

圖2 YY1 在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況 A：YY1 在肝癌組織及配對(duì)癌旁組織的免疫組化染色；B：YY1 在30 對(duì)肝癌組織及配對(duì)癌旁組織的免疫評(píng)分（t 檢驗(yàn)）；C：肝癌細(xì)胞系中YY1 的本底表達(dá)情況；D：蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)YY1 敲降表達(dá)及過(guò)表達(dá)效果；E：q-PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)YY1 敲降表達(dá)及過(guò)表達(dá)效果（t 檢驗(yàn)）

基因集富集分析比較TCGA-LIHC 中高、低表達(dá)YY1 兩組之間差異的信號(hào)通路，我們發(fā)現(xiàn)YY1高表達(dá)組中富集了多種腫瘤相關(guān)的通路，比如KEGG-PATHWAYS-IN-CANCER、KEGG-CELL-CYCLE、KEGG-APOPTOSIS 和 KEGG-VEGF-SIGNALING-PATHWAY。同時(shí)，參與腫瘤發(fā)生及進(jìn)展相關(guān)的分子信號(hào)通路，比如KEGG-ERBB-SIGNALINGPATHWAY、KEGG-MAPK-SIGNALING-PATHWAY、KEGG-NOTCH-SIGNALING-PATHWAY 及KEGGWNT-SIGNALING-PATHWAY也顯著富集于YY1高表達(dá)組中（圖5A，P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05）。這些結(jié)果提示YY1 的表達(dá)上調(diào)可能會(huì)激活這些信號(hào)通路從而促進(jìn)肝癌進(jìn)展。

2.6 YY1 與基因共表達(dá)分析

具有類似表達(dá)模式的基因可能參與相近的分子生物學(xué)功能，因此，我們篩選TCGA、GEO 及ICGC 數(shù)據(jù)庫(kù)中與YY1 表達(dá)顯著相關(guān)的基因，我們將與YY1 表達(dá)相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值超過(guò)0.4，p 值小于0.05 的基因定義為YY1 的共表達(dá)基因，四個(gè)不同的肝癌研究隊(duì)列中篩選出93 個(gè)共表達(dá)基因（圖5B）。經(jīng)過(guò)KEGG 通路富集分析，我們發(fā)現(xiàn)這些共表達(dá)基因主要參與了基因復(fù)制及基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的信號(hào)通路，比如DNA 復(fù)制、RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞周期等（圖5C）。在GO 通路富集分析中，這些共表達(dá)基因參與了P53基因介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)及DNA 復(fù)制等（圖5D）。進(jìn)一步分析中，我們通過(guò)String 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建YY1 與這些共表達(dá)基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，在置信度為0.7（高度可信）時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)93 個(gè)共表達(dá)基因之間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)（249）比預(yù)期的互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)（60）顯著增加（PPI enrichmentPvalue=1.0×10-16）。其中預(yù)測(cè)到 YY1 與8 個(gè)蛋白存在高度可信的互作網(wǎng)絡(luò)，包括FKBP3、RBBP7、H2AFV、ACTL6A、PAXIL1、NCOA6、SUZ12和H2AFZ，提示YY1可能與這8個(gè)共表達(dá)基因存在相互作用關(guān)系，參與調(diào)控相應(yīng)的分子生物學(xué)功能。

3 討 論

YY1 是1991 年被發(fā)現(xiàn)并純化的鋅指類轉(zhuǎn)錄因子，屬于GL1-Kruppel 蛋白質(zhì)家族，編碼基因位于人類14 號(hào)染色體端粒區(qū)q32.2，序列在脊椎動(dòng)物中高度保守［19，20］。作為一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，YY1可以影響大約7%的哺乳動(dòng)物基因的轉(zhuǎn)錄活性，通過(guò)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、大規(guī)模染色體重組及X 染色體失活等參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過(guò)程［21］。多項(xiàng)研究表明YY1 在多種腫瘤中異常表達(dá)，發(fā)揮抑癌或促癌作用。如在乳腺癌、胰腺導(dǎo)管腺癌及食管鱗狀細(xì)胞癌中，YY1 能抑制腫瘤進(jìn)展［7-10］，而在肺癌、胃癌及結(jié)直腸癌中則發(fā)揮促癌作用［11-13］。在肝癌的研究中，Kim 等人報(bào)道 YY1 在細(xì)胞核中的表達(dá)上調(diào)與肝癌不良預(yù)后相關(guān)［14］，Tsang 等人分析50 對(duì)肝癌與配對(duì)癌旁組織免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，YY1 在68%的肝癌組織中表達(dá)量明顯增加［22］。而在Wang LM 等人的報(bào)道中，他們分析了80 對(duì)肝癌組織及配對(duì)癌旁組織的mRNA 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)65%肝癌組織中YY1 表達(dá)低于癌旁組織，而且高表達(dá)YY1 的患者肝癌組織病理學(xué)分級(jí)較好，指出YY1高表達(dá)在肝癌中是保護(hù)因素而非危險(xiǎn)因素［15］。因而不能將YY1 籠統(tǒng)地歸為抑癌基因或癌基因，YY1 在不同腫瘤甚至同一腫瘤中功能的差異性可能與其特殊的結(jié)構(gòu)有關(guān)，YY1 蛋白包含多個(gè)不同的活性催化區(qū)域一方面可直接識(shí)別結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)的YY1 應(yīng)答元件促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄，另一方面還可以通過(guò)招募共激活因子（如p300、CBP或PRMT1 等）或共抑制因子（如HDACs、EZH2 或DNMTs）改變下游基因YY1 應(yīng)答元件附近染色質(zhì)的表觀遺傳修飾狀態(tài)，促進(jìn)或抑制下游基因的表達(dá)［23，24］。

圖3 YY1 對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力的影響 A、B、C：YY1 在TCGA-LIHC 中與增殖相關(guān)基因MKI67、PCNA 和MCM2 顯著正相關(guān)（Spearman 相關(guān)性分析）；D、F：CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲降或過(guò)表達(dá)YY1 后細(xì)胞增殖情況（t 檢驗(yàn)）；E、G：Edu 染色法檢測(cè)敲降或過(guò)表達(dá)YY1后細(xì)胞增殖情況（t 檢驗(yàn)）；H、I：敲降或過(guò)表達(dá)YY1 后細(xì)胞克隆形成能力改變情況（t 檢驗(yàn)）

圖4 YY1 對(duì)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響 A：敲降YY1 表達(dá)后Huh7 遷移、侵襲能力顯著降低（t 檢驗(yàn)）；B：過(guò)表達(dá)YY1 后PLC/PRF/5 遷移、侵襲能力顯著增強(qiáng)（t 檢驗(yàn)）

圖5 基因集富集分析、基因共表達(dá)分析及蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 A：YY1 高表達(dá)的HCC 患者明顯富集多種與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號(hào)通路；B：篩選并確定93 個(gè)TCGA-LIHC、GSE14520、GSE25097 及ICGC-LIRI-JP 數(shù)據(jù)集中的YY1 過(guò)表達(dá)基因；C、D：93 個(gè)YY1 共表達(dá)基因的KEGG、GO 通路富集分析；E：構(gòu)建YY1 與共表達(dá)基因之間的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

本研究分析TCGA-LIHC、GSE14520、GSE25097及ICGC-LIRI-JP 四個(gè)肝細(xì)胞癌研究隊(duì)列中YY1 的表達(dá)及臨床意義，并在本院收集的樣本中進(jìn)行驗(yàn)證，分析結(jié)果均顯示YY1 在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于正常肝組織，且YY1 高表達(dá)能指示患者的不良預(yù)后。值得注意的是YY1 與腫瘤體積、腫瘤分期、腫瘤病理學(xué)分級(jí)密切相關(guān)，提示YY1 可能在多方面影響腫瘤進(jìn)展。我們的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，YY1 可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，進(jìn)一步證實(shí)YY1 確實(shí)可以從多個(gè)方面影響到肝癌細(xì)胞。在探討YY1 在肝癌中發(fā)揮作用的潛在機(jī)制時(shí)，我們分析了TCGA-LIHC 研究隊(duì)列的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，與預(yù)期一致，結(jié)果顯示YY1 高表達(dá)組富集到更多與腫瘤發(fā)生及進(jìn)展相關(guān)的信號(hào)通路。此外，分析YY1 的共表達(dá)基因并構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，YY1 與這些共表達(dá)基因參與DNA 復(fù)制、RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞周期等生物學(xué)過(guò)程，進(jìn)一步提示轉(zhuǎn)錄因子YY1 在肝癌中可能廣泛參與調(diào)控基因復(fù)制及轉(zhuǎn)錄；預(yù)測(cè)到與YY1 存在高度可信的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的基因可能是YY1 的下游靶基因，這可以為我們后續(xù)的機(jī)制研究提供參考和方向。

綜上所述，本研究初步探討了YY1 基因在肝癌中的預(yù)后意義，體外實(shí)驗(yàn)證明YY1 可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖及惡性轉(zhuǎn)化能力，靶向干擾肝癌組織中的YY1 表達(dá)可能是潛在的藥物治療靶點(diǎn)。