人永生化胰腺星形細胞系的構建及其功能的驗證

韓世紀 ，練國達 ，陳少杰 ，黃開紅 *，李佳佳

胰腺癌惡性程度高，腫瘤間質纖維化是其重要病理特征，纖維化程度與不良預后相關［1］。胰腺癌結締組織致密壓迫血管造成組織內有效灌注少，組織本身血管分布較少、缺氧明顯，極大地限制了組織局部的化療藥物濃度及藥效發揮，給胰腺癌治療帶來極大挑戰［2，3］。胰腺纖維化的形成是一個由復雜信號網絡調控、以胰腺星形細胞（pancreatic stellate cells，PSCs）活化為中心、多種細胞因子參與、最終以成纖維細胞增生和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積為特征的復雜病理發展過程［4］。當胰腺損傷或發生病變（如慢性胰腺炎或胰腺癌等）時，PSCs 被激活為肌成纖維樣細胞，增殖活躍、脂質成分減少、表達α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和結蛋白（desmin），以α-SMA 為較公認的PSCs 活化標志。在其活化過程中，伴隨過量細胞外基質蛋白比如Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白（collagen type Ⅰ、Ⅱ）、纖維結合蛋白（Fibronectin）表達，基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）及其抑制劑的合成，這些基質成分也是導致胰腺癌耐藥的重要原因之一［4，5］。

近年來，PSCs 相關研究越來越多，但大部分實驗用細胞主要來源于小鼠或大鼠胰腺分離的PSCs，僅有部分實驗使用組織塊outgrowth 培養法獲得原代培養的人 PSCs（human PSCs，hPSCs）［6-12］。由于胰腺組織來源有限，原代培養條件復雜且耗時，純化得到的原代細胞持續分裂能力有限，多使用第3 代至第 8 代［12，13］；并且由于同一標本所得 PSCs 難以持續分裂足夠細胞用于后續功能實驗；而不同組織標本來源PSCs 異質性較大，實驗數據一致性和可靠性差。隨著科學技術發展，永生化建細胞系技術逐漸成為構建預期表型細胞系的重要手段之一。所謂的“永生化”是指培養細胞在體外能穩定傳代、生長，但又不發生惡性轉化，即不具有癌細胞的特征。為了彌補目前PSCs 實驗細胞來源不足的缺陷，國外有部分實驗室報道采取慢病毒轉染的方法建立了鼠 PSCs（mice PSC，mPSC）和hPSCs 永生化細胞系［14-16］。早期永生化建系時，單獨使用猿猴病毒 40（Simian virus 40，SV40）轉染獲得的永生化細胞效率較低［17］。為克服細胞分裂過程中端粒縮短現象，在正常細胞中導入端粒酶反轉錄酶催化亞基基因（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）是目前用于維持端粒結構完整和穩定的最有效途徑，可防止細胞復制性衰老，使正常上皮細胞永生化［18-20］；近年來聯合SV40T 抗原基因和hTERT 基因己成功用于人乳腺成纖維細胞和內皮細胞，瞼板腺上皮細胞等細胞永生化建系［21，22］。

本部分實驗中，我們使用重組慢病毒將SV40LT基因和hTERT 基因導入原代hPSCs 中，通過抗性藥物篩選及擴大培養，細胞免疫熒光、Western blot和qRT-PCR、染色體核型分析、生長曲線測定、裸鼠成瘤實驗等研究其表型，建立一株人胰腺星形細胞永生化細胞系；并將該細胞系與胰腺癌細胞在體外進行共培養，證實其生物學功能。為胰腺星形細胞相關研究提供充足細胞來源，以保證后續科研工作的進一步開展。

1 材料與方法

1.1 采用outgrowth 方法培養原代PSCs

1例胰腺癌組織標本來自于2020年5月我院肝膽外科手術切除，病理診斷為高分化胰腺導管腺癌標本，利用outgrowth 法培養獲得。具體步驟如下：標本由含有青霉素/鏈霉素的PBS 沖洗，剪成直徑2～3 mm 組織塊，種植于含有10%FBS（Gibco，CA，USA）及 2 mmol/L 谷氨酰胺的 DMEM/F-12（1∶1）（Gibco，CA，USA）培養基的六孔板中，每孔3～5 塊組織，37℃、5% CO2條件下培養；24 h 換液，48 h 換板，后 2～3 天換液，5～7 天 hPSCs 生長出組織塊并附壁于孔板。至細胞密度達到約80%～90%，胰酶消化后傳代。

1.2 SV40LT 和hTERT 重組慢病毒轉染及永生化細胞篩選

挑選生長狀態良好的第3代hPSCs，以5×104/mL接種于96 孔板，使用DMEM/F-12 完全培養基稀釋pdybrene 至終濃度50 μg/mL；更換培養基加入SV40LT 和hTERT 病毒液（上海吉凱基因科技有限公司）進行細胞感染，為im PSCs 組，陰性對照組為NC PSCs 組；12 h 觀察細胞狀態，更換為完全培養基；感染72 h 熒光顯微鏡觀察細胞感染效果，確認感染條件和感染參數；后將成功感染的im PSCs轉至培養瓶，37℃、5% CO2條件下，用含 2 μg/mL嘌呤霉素的無血清培養基連續篩選14 d；后用含1 μg/mL 嘌呤霉素完全培養基繼續培養。

1.3 轉染細胞SV40LT 和hTERT 的RNA 表達水平驗證

利用 TRIzol Reagent（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）從穩轉細胞（imPSCs）中提取RNA，然后使用PrimeScriptTMRT（TakaRa，大連，中國）試劑盒逆轉錄成 cDNA。使用 SYBR?PremixEx TaqTM II（Taka-Ra，大連，中國）的試劑盒，在 LightCycler?96SW 1.1 qRT-PCR 系統（Roche，Basel，Switzerland）上進行PCR 擴增反應，反應條件為：95 ℃2 min 預變性，然后按 95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40 個循環，最后 72 ℃ 7 min 延伸。用 GAPDH 作為內參。結果通過2-△△CT法分析基因相對表達量。SV40LT 和hTERT 引物合成于廣州睿博興科生物公司。

1.4 轉染細胞SV40LT 和hTERT 的蛋白表達水平驗證

穩轉細胞（imPSC），預冷 PBS 清洗 2 次，用含有蛋白酶抑制劑（PMSF）的RIPA 裂解緩沖液裂解細胞并測定蛋白濃度。取等量總蛋白于10%SDSPAGE 膠電泳。然后將凝膠轉移至PVDF 膜中，恒流（250 mA）轉膜150 min；取出PVDF 膜，置于5%脫脂奶粉中封閉2 h，加入一抗（SV40LT 和hTERT購買自美國Cell Signaling Technology 公司，1∶1000稀釋），4 ℃過夜，TBST 洗膜；二抗37 ℃搖床孵育1 h，TBST 洗膜。ECL 化學發光試劑盒顯影曝光。

1.5 免疫熒光驗證SV40LT 和hTERT 穩轉細胞系生物學表型情況

穩轉細胞（imPSCs）消化種板，貼壁后棄上清，PBS 輕洗，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS 輕洗；0.2%Triton X-100/PBS 室溫透化 10 min；PBS 輕洗，1% BSA/PBS 室溫低速搖床封閉30 min；去除封閉液，孵育一抗（α-SMA、Collagen I、Fibronectin 抗體購買自美國Abcam 公司，1∶200 稀釋），4 ℃過夜；棄去抗體，PBS 輕洗，孵育熒光二抗（美國Abcam公司），室溫低速搖床孵育30 min；去除抗體，PBS輕洗，DAPI 工作液染核5 min，PBS 輕洗，加入PBS，至于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.6 核型分析驗證SV40LT 和hTERT 穩轉細胞系生物學表型情況

將imPSCs 細胞消化種板，貼壁后；將秋水仙素（終濃度0.2 μg/mL）加入培養液中，繼續培養4 h；胰酶消化后收集細胞，1000 r/min 離心10 min，棄上清。加入0.5 mL 37 ℃預熱的0.075 mol/L KCL混勻，緩慢補充至10 mL，混勻37 ℃孵育20～30 min；管中加入1 mL 新鮮固定液，室溫固定5 min，1000 r/min離心10 min，棄上清。緩慢加入新鮮固定液1 mL，室溫固定30 min，吹打均勻，1000 r/min離心10 min，棄上清。取0 ℃冰凍的載玻片，距玻片15 cm高度，向玻片滴加1～2 滴細胞懸液，室溫干燥。Giemsa染色10～20 min，流水沖洗玻片背面，晾干。二甲苯透明，中性樹膠封片，油鏡下隨機計數50 個處于分裂相的染色體，選取10 個分散好的G 顯代標本進行染色體核型分析。

1.7 細胞生長曲線驗證SV40LT 和hTERT 穩轉細胞系生物學表型情況

將im PSCs 細胞消化后種于96 孔板，細胞1×104/mL，100 μL/孔鋪板，3 個復孔；采用 CCK8 法，連續 10 天，每 24 h 測 450 nm 處 OD 值，以時間為橫軸，細胞數為縱軸做曲線即為生長曲線。

1.8 裸鼠成瘤實驗觀察SV40LT 和hTERT 穩轉細胞系動物體內成瘤能力

取 6～8 周齡，雌性 Balb/c-nu 裸小鼠 6 只，16～18 g 環境適應7 天后，裸鼠被隨機分配至兩組，進行細胞注射，觀察細胞成瘤能力。其中陽性對照組：人胰腺細胞癌Panca-1；實驗組：imPSCs（n=3）。5×106細胞重懸于0.1 mL PBS，注射于裸鼠左協腹部；后每周觀察小鼠精神、飲食及排便情況，稱重小鼠體重，用游標卡尺測量腫瘤結節的長度和寬度。觀察8 周后終止實驗，斷髓處死小鼠取瘤塊稱重。摘取瘤體固定于4%甲醛用于組織學研究。

1.9 SV40LT 和hTERT 穩轉細胞系促胰腺癌細胞增殖遷移侵襲能力的情況

將 imPSCs 和原代 hPSCs 利用 Transwell 小室與胰腺癌Panc-1 細胞（中國科學院上海細胞庫）共培養，將imPSCs 和原代hPSCs 分別種植在上室，Panc-1 在下室，37 ℃、5% CO2條件下培養48 h；后將Panc-1 細胞胰酶消化后，分別種板；采用CCK8法檢測Panc-1 細胞增殖能力改變、Transwell 小室檢測Panc-1 細胞遷移侵襲能力改變，未共培養的Panc-1 細胞做對照。

1.9.1 CCK8法檢測Panc-1細胞增殖能力改變 將共培養后Panc-1 細胞消化后種于96 孔板，細胞1×104/mL，100 μL/孔鋪板，3 個復孔；采用 CCK8 法，連續 7 天，每 24 h 測 450 nm 處 OD 值，檢測細胞生長增殖情況。

1.9.2 劃痕實驗檢測Panc-1 細胞增殖能力改變將6孔板接種細胞前先用marker筆在孔板背面畫橫線標記；共培養后Panc-1細胞消化后3×105/孔接種，細胞鋪滿板底后，用1 mL 槍頭垂直于孔板制造細胞劃痕，吸去培養液，PBS 沖洗三次，洗去細胞碎片。加入無血清培養基，12 h、24 h取出拍照記錄。

1.9.3 Transwell 小室檢測Panc-1 細胞遷移侵襲能力改變 侵襲試驗前，Transwell 上室鋪250 μg/mL Matrigel 膠，37 ℃4 h，遷移試驗無需鋪膠。共培養的和對照Panc-1 細胞按1×104/孔接種在上室，下室加入500 μL 含10% FBS 的完全培養基，37 ℃、5%CO2條件下培養20 h（遷移試驗）或40 h（侵襲試驗）。純甲醛室溫下固定細胞15 min，PBS 洗2 次，室溫風干5 min；Wright-Giemsa 應用染色液染色30 min，雙蒸水洗3 次，室溫風干；顯微鏡下觀察，計算穿膜細胞數。

1.10 統計學方法

應用SPSS 17.0 統計軟件進行統計分析，結果以均數±標準差（mean ± SD）表示，兩組間定量資料比較，符合正態分布者采用t檢驗和方差分析，不符合者采用Mann-WhitneyU檢驗。統計檢驗均為雙側檢驗，檢驗水準α=0.05，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 穩定高表達SV40LT 基因和hTERT 基因hPSCs 細胞系的建立

通過outgrowth 方法提取的原代hPSCs，貼壁良好，呈多角形和梭形（圖1A）；傳至第3 代時，將SV40LT 重組慢病毒和hTERT 重組慢病毒轉染hPSCs 細胞中，以獲得穩定高表達兩個基因的hPSCs細胞株（稱為im PSCs），陰性對照病毒為對照細胞株（nc PSCs）。由于慢病毒載體自帶GFP熒光蛋白，顯微鏡下可看到imPSCs 呈梭形、帶有綠色熒光，而hPSCs 和ncPSCs 則不帶有綠色英光，提示imPSCs成功感染慢病毒（圖1A）；且三組細胞生長狀態和形態基本一致，提示病毒感染對細胞生長狀態和形態未產生明顯影響。病毒感染72 h 后，熒光顯微鏡確定成功轉染后，用嘌呤霉素連續篩選14 d，后常規傳代培養，并進行qRT-PCR 和Western blot檢測兩個基因的表達情況。結果顯示，與陰性對照組相比，imPSCs 細胞 SV40LT 和 hTERT 基因在mRNA（圖1B）和蛋白（圖1C）水平表達量均顯著升高，提示慢病毒感染成功。

2.2 免疫熒光方法檢測穩轉細胞系im PSCs 生物學表型情況

圖1 永生化PSCs（imPSCs）驗證 A：胰腺星狀細胞呈梭形和多角形，永生化imPSCs 顯微鏡下呈星芒狀綠色熒光，證實慢病毒轉染成功；B：qRT-PCR 方法驗證hTERT 和SV40 基因高表達；C：Western blot 方法驗證hTERT 和SV40 基因高表達

經過嘌呤霉素連續篩選的穩定高表達SV40LT和 hTERT 的 imPSCs，具有活化 PSCs 的功能，可表達α-SMA、Collagen I、Fibronectin 蛋白。如圖 2 所以，免疫熒光方法檢測imPSCs 呈典型的活化狀態，高表達α-SMA、Collagen I、Fibronectin 蛋白。

圖2 細胞免疫熒光imPSCs 表達α-SMA、Collagen I、Fibronectin 蛋白（藍色細胞核，紅色目的蛋白）

2.3 im PSCs 染色體核型分析及生長曲線

觀察第15 代im PSCs 細胞染色體核型分析可見，im PSCs 染色體總數增多，提示細胞處于分裂相（圖3A）。將imPSCs 和ncPSCs 消化后種板，采用CCK8 法連續10 天檢測細胞增殖情況，imPSCs 細胞呈典型的“S”型（圖3B），增殖能力較對照組明顯增加，且形態未發生改變。這些結果提示imPSCs有不斷增殖分裂的能力，具有永生化的潛能。

圖3 imPSCs 表型情況 A：染色體核型分析證實永生化imPSCs 染色體數目增多；B：生長曲線呈典型的“S”型；C：體內證實imPSCs不具有成瘤能力，無惡性表型轉化（紅色箭頭接種部位）

2.4 細胞成瘤實驗

取imPSCs 細胞及胰腺癌Panc-1 細胞，分別接種于裸鼠背部，連續培養2 月，觀察到imPSCs 組未形成瘤塊（圖3C）；而Panc-1 組在接種2 周后可觀察到腫瘤形成，并逐漸增大。實驗終點，取出腫瘤組織行HE 染色，顯示細胞核排列雜亂、大小不一的特點（圖3C）。該結果說明成瘤實驗操作無誤，imPSCs 在裸鼠內無成瘤性，無惡性轉化。

圖4 imPSCs 促胰腺癌細胞增殖能力驗證 A：imPSCs 和hPSCs 與胰腺癌Panc-1 共培養后，胰腺癌Panc-1 細胞增殖速度增快；B：細胞劃痕實驗證實imPSCs 的促癌作用

2.5 檢測imPSCs 和人原代hPSC 同樣的促胰腺癌細胞增殖能力

將人原代hPSCs 和imPSCs 分別與胰腺癌Panc-1 細胞共培養，48 h 后消化Panc-1 細胞分別行CCK8、細胞劃痕實驗和遷移侵襲實驗，未共培養Panca-1 做對照，結果顯示和 hPSCs 和 imPSCs 共培養的Panc-1 細胞增長速度明顯快于對照組，hPSCs和imPSCs 兩組之間沒有明顯差異（圖4A）。劃痕實驗結果亦提示永生化細胞系具有促imPSCs 增殖能力（圖4B）；遷移侵襲實驗顯示同樣的結果，hPSCs 和imPSCs 組穿膜細胞數明顯多于對照組（P＜0.05），但 hPSCs 和 imPSCs 兩組之間沒有差異（圖5）。

3 討 論

圖5 imPSCs 促胰腺癌細胞遷移侵襲能力驗證：imPSCs 和hPSCs 與胰腺癌Panc-1 共培養后，與未共培養Panc-1 細胞相比，遷移侵襲能力增加（*P＜0.05 vs.Control）；imPSCs 和hPSCs 對比無差異

胰腺癌癥狀隱匿，早期診斷率低且惡性程度高，大部分患者確診時已是晚期，失去了手術機會，化療是主要治療方法；即使使用一線化療藥物吉西他濱，5 年生存率仍低于 5%［1，2］。間質纖維化使化療藥物難以滲透入腫瘤組織內部，這是導致胰腺癌患者化療效果差的重要原因之一［23］，針對腫瘤間質進行干預以提高抗腫瘤效果是胰腺癌研究的熱點和新方向［24］。PSCs 是胰腺癌間質成分的主要來源，是腫瘤間質主要的研究靶點；但其沒有可供使用的細胞株，使用鼠源或人原代培養純化的hPSCs，持續分裂能力有限，且來源于不同組織標本原代分離的細胞會受標本來源的性別、年齡、遺傳背景等方面的影響，實驗數據的穩定性較差。鑒于此，構建永生化PSCs 細胞系對于進行PSCs 及其與胰腺癌細胞之間的研究非常必要。

研究發現，SV40LT 抗原可通過與抑癌基因Rb及P53 相互作用發揮促進細胞轉化和永生化的功能［25-27］，重組慢病毒 hTERT 基因導入細胞后可通過重建端粒酶活性的方法使細胞具有永生化功能。在此研究基礎上，我們擬聯合使用SV40LT 基因和hTERT 基因構建永生化PSCs 細胞系并驗證其功能，將其運用到后續實驗研究中。

我們收集胰腺癌患者外科手術組織標本，采用outgrowth 方法提取并純化原代PSCs，顯微鏡下觀察到呈多角形和梭形的細胞，生長狀態良好；然后采用慢病毒感染方法將SV40LT 抗原基因和hTERT 基因導入細胞內，采用嘌呤霉素篩選。由于慢病毒帶有GFP 質粒，自帶綠色熒光，成功感染病毒的hPSCs在顯微鏡下會發出強綠色熒光。確定成功感染病毒后進一步通過qRT-PCR 和Western blot 方法驗證細胞內SV40T 和hTERT 基因的表達情況，結果顯示在mRNA 和蛋白水平，這兩個基因均高表達，提示病毒感染后這兩個基因成功轉入hPSCs 發揮作用。為進一步明確成功導入兩個基因的imPSCs 是否具有永生化的功能及保持PSCs活化的表型，采用CCK8 法觀察imPSCs 生長狀態，生長曲線顯示其呈典型的“S”型生長趨勢，且隨著培養時間延長，細胞生長狀態良好；核型分析顯示imPSCs 細胞染色體總數增多，大部分細胞處于細胞分裂狀態；這些結果均提示imPSCs 細胞呈現良好的分裂能力，具備持續分裂潛能。為驗證永生化imPSCs 是否具備活化PSCs 的表型，我們采用免疫熒光方法驗證其活化標記物α-SMA 和基質蛋白Collagen I、Fibronectin 表達情況，結果顯示 imPSCs高表達α-SMA、Collagen I、Fibronectin 蛋白，保持為PSCs 的活化狀態。imPSCs 細胞染色體總數發生改變，為驗證其是否發生惡性表型轉化，采用裸鼠皮下成瘤的方法驗證，接種8 周后imPSCs 組未出現皮下腫瘤組織，而對照胰腺癌細胞株Panc-1 組長出腫瘤組織。以上這些結果表明，永生化imPSCs 不僅保持了PSCs 的形態和活化狀態，還具備了持續分化的潛能、未發生惡性表型轉化，細胞系構建成功，可用于相關研究。

PSCs 活化后，可分泌多種細胞因子及生長因子與胰腺癌細胞相互作用，促腫瘤轉移侵襲等能力明顯增強［5，6］。為進一步驗證 imPSCs 的促瘤作用，我們將imPSCs 和腫瘤細胞共培養，未共培養的腫瘤細胞作陰性對照，與人原代hPSCs 共培養的腫瘤細胞做陽性對照。采用CCK8 法和細胞劃痕實驗觀察腫瘤細胞增殖情況、遷移侵襲實驗觀察腫瘤細胞轉移侵襲能力；結果表明，共培養的兩組腫瘤細胞增殖、轉移侵襲能力較未共培養組明顯增強，且imPSCs 和人原代hPSCs 促腫瘤增殖、轉移侵襲能力相當。這些結果說明imPSCs 還保持了人原代PSCs 的促腫瘤作用，可以運用于與胰腺癌腫瘤細胞相關關系研究。

綜上所述，本研究利用胰腺癌組織標本獲得原代PSCs，并采用慢病毒轉染方法，導入SV40LT 和hTERT基因，構建一株穩定高表達兩個基因的人胰腺星形細胞系imPSCs，并采用多種方法驗證imPSCs不但具有人胰腺星型細胞的生物學特性和功能，且未發生惡性表型轉化，為胰腺星形細胞自身功能和其與胰腺癌細胞相互作用關系、胰腺癌腫瘤微環境相關研究提供了可靠、理想的實驗模型。