錨蛋白重復結構域1的研究進展

黃川明 陳日玲

【摘要】 錨蛋白重復結構域1（ANKRD1）也被稱為心肌錨定重復序列蛋白（CARP），由ANKRD1編碼，是一種應激反應蛋白，為細胞質中的重要組成部分，而且是細胞核轉錄的重要輔助因子。其在細胞的表達水平，定位甚至病理應激類型不同，可發揮不同的功能。CARP作為肌肉錨蛋白重復蛋白家族的一員，在各種心臟疾病中高表達，但其發揮作用的機制及對相關病理生理學仍不清楚。本文從ANKRD1的結構及其在心臟疾病中的作用進行闡述。

【關鍵詞】 錨蛋白重復結構域1 心肌錨定重復序列蛋白 心臟疾病

Research Progress of ANKRD1/HUANG Chuanming， CHEN Riling. //Medical Innovation of China， 2021， 18（20）： -188

[Abstract] ANKRD1 also known as cardiac anchored repeat protein （CARP）， is a stress response protein encoded by ANKRD1， ANKRD1 is an important component of cytoplasm and an important cofactor of nuclear transcription. The expression level， location and even pathological stress type of cells are different， which can play different functions. As a member of ankyrin repeat protein family， CARP is highly expressed in various heart diseases， but its mechanism and pathophysiology are still unclear. Here we describe the structure of ANKRD1 and its role in heart disease.

[Key words] ANKRD1 CARP Heart disease

First-author’s address： Guangdong Medical University， Zhanjiang 524003， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.20.045

1995年，Chu等[1]首次在白介素（IL）-1A和腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導的人血管內皮細胞中發現心肌錨蛋白重復蛋白（cardiac anchinin repeat protein，CARP）為細胞因子誘導因子（C-193）。隨后，它也被發現分布于肌節I帶中，與肌聯蛋白相互作用[2]。CARP在細胞中不同定位有不同作用，在骨骼肌及心肌細胞中，主要分布在細胞核之間，它與YB-1等轉錄因子相互作用，扮演轉錄共調節蛋白的角色，在細胞質中，它與其他肌漿蛋白結合，成為結構或信號傳導成分[3-6]。CARP的基因被鑒定為一個胎兒基因，CARP在胚胎和胎兒心臟發育階段檢測到高水平表達，隨著年齡增長，特別是在成年人中，其表達水平明顯降低，越來越多的證據表明，CARP突變可導致各種心血管疾病，包括肥厚型心肌病、擴張型心肌病和心力衰竭等[7-9]，但其具體機制仍不清楚。細胞凋亡在心衰的發展過程中起著至關重要作用[10]，人們認為腫瘤抑制基因p53和Bax促進心肌細胞凋亡，有趣的是，最近有證據表明CARP充當p53的共激活因子，并調節其轉錄活性，這些發現提示CARP可能通過促進心肌細胞凋亡而加速心肌疾病的進展[11]。目前，關于錨蛋白重復結構域1（ANKRD1）影響其他細胞凋亡的研究較少，來自韓國實驗室的三份報告表明，ANKRD1的異位表達可促進肝癌細胞凋亡[12]。這使得CARP的高水平表達是有利還是有害仍沒有共識。這些發現表明CARP對細胞凋亡的影響可能與環境及不同類型的細胞相關。

1 結構

CARP位于人類10q23.31號染色體上，其cDNA全長約1 900個堿基對，由ANKRD1基因編碼，共編碼319個氨基酸的蛋白產物，分子量約37 kDa，其序列在哺乳動物中高度保守[13]。CARP蛋白由以下幾個特點，（1）卷曲螺旋域：由2～5個α螺旋組成的超螺旋相互纏繞形成，在結構上可以介導蛋白質的齊聚;（2）串聯錨蛋白重復序列：CARP在蛋白C端有數個重復序列，存在著反α螺旋和右手螺線管型結構，介導蛋白與蛋白之間的作用，具有多種功能，包括轉錄調控、細胞周期調控、離子運輸、細胞骨架完整性、內吞作用和信號轉導等;（3）核定位信號;（4）PEST樣區域：該區域富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，參與蛋白質的快速降解，因此，許多短壽命蛋白中均有表達，如G1細胞周期蛋白和p53等;（5）多個蛋白磷酸化位點：這些位點可被蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ等酶磷酸化，如蛋白激酶C能在Thr11、Ser305位點被磷酸化;此外，在5’-非翻譯區，CARP含有9個外顯子和幾個典型的元件，包括GATA-box、AT-rich、E-box和TATA-box[14-15]。對于不同的物理、化學刺激和在特定的環境下，CARP也呈現出不同表達水平。例如，在抗腫瘤藥物阿霉素的環境下，CARP表達受到明顯抑制，缺氧和熱應激則會輕度降低CARP表達;相反，在IL-1α和TNF-α刺激下，人血管內皮細胞中CARP的mRNA顯著增加，在小鼠的心肌細胞中也可得到相同的結果。另外，在疲勞運動、傷口愈合和血管生成的過程中，其在骨骼肌中的表達也會明顯增加。到目前為止，已經發現了幾個與CARP相關的具有多種功能的物理伴侶，表明其具有多種功能，如與參與生物力學應力傳感的肌蛋白相互作用，并與肌體完整性相關的肌蛋白密切聯系。它還與Y-box轉錄因子1及連接酶MuRF1一起調控蛋白質的精確翻譯，也有證據表明，CARP能預防過早細胞衰老的細胞凋亡[16-17]。

2 CARP/ANKRD1與心臟疾病的關系

心肌肥厚是心臟后負荷增加的適應性反應，其特征是心室肥厚和舒張功能障礙，并伴有心肌細胞的增大和心肌成纖維細胞合成增強[18]。心臟CARP的表達在各種肥厚性刺激（包括壓力超載和機械應激）反應中顯著增加，有大量研究證實了這一現象[1，4]。Song等[19]培養了CARP過表達的轉基因小鼠，通過與野生型小鼠相比，發現它們在對壓力超載的反應中，心肌肥厚明顯減少，他們認為CARP可以通過抑制心肌細胞介導的ERK1/2和TGF-β通路，減少心肌細胞纖維化，從而減輕心肌細胞肥大;通過增加TGF-β可以逆轉CARP對異丙腎上腺素引起的心肌細胞肥厚反應的抑制作用，從而證實CARP的表達是對各種應激的適應性和保護性反應。相反，Bang等[20]對敲除CARP等基因的4個月齡小鼠和野生型小鼠進行了動脈收縮（TAC），采用超聲心動圖評價TAC術前和14 d的心功能，發現兩組壓力梯度相似，心室壁厚度和體積增加程度均相當，表明CARP對心臟的正常發育和功能以及對機械壓力過載的反應不是必需的。文獻[21]通過分析384例心肌肥厚患者，在試驗組和對照組均發現了內含子變異、非同義替換和同義變異，但在心肌肥厚組檢測到了3個錯義突變，Pro52Ala、Thr123Met、Ile280Val。他們認為CARP突變影響了其與肌動蛋白的作用及在細胞中的定位，從而影響了其基因調控功能。這提示了CARP在維持肌節或肌蛋白功能完整性上有著重要作用[4]。因此，CARP目前在肥厚細胞中的作用仍有較多爭議，其在心肌肥厚的具體機制及調控仍有待進一步研究。

擴張性心肌病（DCM）是指在沒有異常負荷條件（高血壓、瓣膜病）或足以引起整體收縮功能損害的冠狀動脈疾病的情況下，存在左心室擴張和收縮功能不全。Duboscq-Bidot等[22]對231例DCM患者的ANKRD1編碼區進行了測序，發現2例家族突變（p.Thr116Met和p.Ala276Val）和3例散發病例（p.Glu57Gln、P.Arg66Gln和p.Leu199Arg突變），并在遺傳和功能分析的基礎上驗證了這一突變。他們認為這些突變影響了高度保守的氨基酸殘基，同時也抑制了MLC2v啟動子和影響肌蛋白功能，從而影響了信號傳導和蛋白功能，導致疾病發生。Moulik等[23]在4例DCM患者中，發現了3種錯義突變（P105S、V107L和M184L）。M184L突變導致CARP與Talin1和FHL2的結合缺失，P105S突變導致Talin1結合缺失，這些突變影響了心肌細胞正常的信號傳導以及肌節和細胞骨架結構成分。另外，P105S突變可導致p53下調，這意味著CARP與心肌細胞的生長周期和凋亡相關[24]。因此。CARP可能在擴張性心肌病發揮著積極作用，但這需要進一步去驗證，其具體機制也不清楚。

心力衰竭主要是由潛在的心肌疾病引起的，然而，心臟瓣膜疾病、心內膜或心律失常也可能導致心臟功能障礙。在心力衰竭患者中，發現心肌CARP水平顯著增高，提示CARP的表達在心衰的過程中發揮著重要的作用。Kempton等[25]早期研究表明了細胞骨架蛋白βⅡ參與蛋白翻譯以及在心力衰竭患者表達顯著增加，后來又證實βⅡ蛋白調控著CARP表達，他們的研究表明CARP是一種動態分子，隨后負荷與壓力改變而變化，并且認為其有潛力作為一種生物標志物來評估心室輔助治療的預后指標。Herrer等[26]通過對29例心臟病患者進行RNA測序分析，發現細胞骨架在心力衰竭患者中出現改變，他們鑒定出包括CARP在內的60個細胞骨架相關基因，進一步研究得出CARP可影響細胞骨架變化，導致心肌細胞結構破壞，影響了心肌細胞的收縮能力。

阿霉素（Dox）是一種蒽環類抗腫瘤藥物，它可以破壞心臟特異的基因表達程序，引起肌節紊亂和肌絲丟失為特征的依賴性心臟毒性，這極大地影響其在臨床中的應用。Jeyaseelan等[27]發現一種在心肌細胞中表達明顯增加的核蛋白，其mRNA水平對Dox非常敏感，因此他們將其命名為心臟阿霉素反應蛋白（CARP）。而該研究證實了CARP可以抑制阿霉素對細胞引起的氧化應激作用，其中絲氨酸/蘇氨酸激酶通路起著關鍵作用。Chen等[28]在共轉染實驗中發現，GATA4通過激活CARP近端啟動子而作用與CARP上游，用腺病毒過表達GATA4維持其在心肌細胞中的水平，可稍微提高CARP的表達，并減少Dox引起的肌節紊亂，該研究表明，阿霉素同時消耗心肌細胞中的GATA4和CARP，在一定程度上參與了肌纖維紊亂和蒽環類心肌病的病理生理過程[16]。

細胞凋亡的特征是細胞聚集（固縮），細胞體積減少，染色質凝結和核碎裂，而細胞膜保持完整性。外部和內部刺激可以觸發死亡受體介導（外部）或線粒體介導（內部）的凋亡。死亡配體如TNF-α和Fas配體與各自的膜受體結合，激活死亡受體通路。而CARP正是在TNF-α刺激下，誘導血管內皮細胞表達水平增加的，說明了CARP也參與細胞凋亡的作用。線粒體的損傷導致不規則的氧化磷酸化、活性氧（ROS）增加引起的氧化應激以及線粒體外膜通透性的改變。Bax/Bak是Bcl-2家族的促凋亡蛋白，受Bcl-2及其相關抗死亡的蛋白負調控。大鼠心臟缺血缺氧再灌注損傷，可誘導凋亡相關基因GADD153過表達，導致CARP下調，表明CARP具有抗凋亡作用。Zhang等[16]的研究表明，在體外缺氧/復氧和體內缺血/再灌注實驗模型，CARP作為轉錄因子GATA-4的輔助因子，可誘導抗凋亡基因Bcl-2的表達，進一步支持CARP作為抗凋亡因子的作用。相反，Shen等[11]研究表明，CARP高水平表達可通過p53蛋白影響線粒體功能而促進心肌細胞凋亡。另外，也有證據表明CARP與人類肝癌細胞凋亡增加相關。Caspase是一類內源性蛋白酶，在程序性細胞死亡和炎癥中發揮重要作用。在哺乳動物中，caspase 3可以激活caspase級聯信號，負責執行凋亡。研究表明，CARP在靠近其N端殘基區域被caspase 3剪切，說明CARP參與了細胞凋亡作用，然而，隨后的一項研究表明，采用caspase 3抑制劑并不能影響大鼠心室細胞CARP的降解[17]。因此，CARP似乎能在不同條件下增強或抑制細胞凋亡，這些發現表明CARP對細胞凋亡的影響可能與環境及不同類型的細胞相關。

目前對于CARP的調控機制尚不清楚。CARP啟動子活性的調控轉錄增強因子-1（TEF-1）作為CARP啟動子基礎活性的必需結合因子，結合在M-CAT元件上，可能在蛋白激酶通路下游中調控CARP的表達。作為Nkx2.5的下游靶點，Nkx2.5直接控制CARP的啟動子活性來激活轉錄，另外有證明表明GATA-4也參與其中。此外，腫瘤抑制因子p53可上調骨骼肌細胞中CARP啟動子的活性;GADD153在缺氧誘導的凋亡過程中，可降低CARP的表達。文獻[17]認為，泛素-蛋白酶體酵解途徑是調節蛋白質的主要機制，其提供了一種蛋白質質量的控制形式，對維持心臟功能至關重要，CARP和骨骼肌細胞特異的RING（really interesting new gene）和MuRF2相互作用，這兩種蛋白是與肌節相關的E3泛素連接酶，催化泛素向蛋白質底物轉移，并向蛋白酶體降解發出信號。此外，caspase 3作為細胞凋亡的執行蛋白，也有研究證實其在CARP編碼區域有相應的剪切位點[17]。因此，對于CARP的表達是多種因素控制的，并且因不同的病理刺激和細胞類型，其結果可能不同。

3 小結

CARP是一種多功能蛋白，如在胎兒心臟基因表達的負轉錄調控、肌纖維組裝、心肌細胞的重塑、細胞骨架蛋白和對機械刺激的信息傳遞。它在體內高水平表達是心臟的致病因素，還是對心臟損傷的適應性反應，這仍不清楚。作者認為，根據現有的數據，對于CARP在心臟中表達增加，更是一種對心臟的積極保護作用，但是如果不給予控制，可能會適得其反，反而加重心臟疾病的病理生理過程。

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（收稿日期：2021-05-10） （本文編輯：張爽）