基于網絡藥理學探究壽胎丸治療先兆流產作用機制

楊柳青，陳 赟，繆晨韻，趙 穎，王如燁，章 勤

(浙江中醫藥大學附屬廣興醫院，浙江 杭州 310007）

先兆流產(threatened abortion,TA) 指孕28 周前出現陰道流血、腹痛腰酸等癥狀,婦科檢查宮頸口未開,無妊娠物排出,是最常見的妊娠并發癥之一,發病率為20%～25%,嚴重影響婦女身心健康,若未及時治療,則發展為難免流產［1-3］。先兆流產病因復雜,其病因機制尚未完全闡明,西醫治療一般采用臥床休息、禁止性生活,并予以人絨毛膜促性腺激素、黃體酮等藥物治療［1,4］。該病歸屬中醫“胎漏、胎動不安” 范疇,中醫藥治療先兆流產有數千年歷史,臨床療效顯著,不良反應少。中醫理論認為腎藏精,主生殖,為五臟之本,元氣之根,腎氣的強弱是胎元能否穩固的關鍵,所以腎虛為其基本病機［5］。壽胎丸出自張錫純所著《醫學衷中參西錄》,具有補腎固沖,安胎之功,主治婦人滑胎,后世醫家多以本方為安胎基礎方隨證化裁進行臨床應用,并被“十一五” 國家級規劃教材—《中醫婦科學》 收錄為腎虛型“胎漏、胎動不安” 主治方劑,已成為中醫臨床治療先兆流產經典名方［6-7］。

網絡藥理學一詞,最先由英國藥理學家Andrew L Hopkins 于2007 年提出,并在2008 年將其作為“下一代藥物研發模式” 進行闡述［8-9］。網絡藥理學是指應用系統生物學和多向藥理學方法構建生物學網絡,從網絡平衡的整體角度描述生物系統、藥物和疾病之間的相互作用,研究中藥的藥理作用、機制和安全性［10］。通過構建的網絡可顯示:一種疾病可由多種不同基因調控；單個基因亦可調控多種疾病,與中醫學“同病異治” 和“異病同治” 的理論契合。此外,網絡藥理學能從整體角度系統分析中藥復方“多成分-多靶點” 的作用機制,其“系統性、整體性” 的特點與中醫中藥“整體觀、辨證論治” 的原則相吻合。網絡藥理學能揭示中藥藥效物質基礎及其分子機制,使中醫藥研究從經驗醫學向循證醫學轉變,有效地推動中藥復方的深入研究,對現代中藥的研究和開發具有重要意義［10-12］。因此,本研究通過網絡藥理學方法挖掘壽胎丸治療先兆流產可能的潛在活性成分及作用靶點,構建蛋白相互作用(PPI) 及中藥復方-成分-靶基因-疾病網絡,進行基因本體(GO) 富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG) 通路富集分析,為壽胎丸治療先兆流產提供相關科學性依據及啟發。

1 方法

1.1 壽胎丸的活性成分收集 通過檢索中藥系統藥理學分析平臺 (TCMSP)［13］(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php) 和TCMID［14］(http://119.3.41.228 ∶8000/) 收集壽胎丸中菟絲子、桑寄生、續斷、阿膠化學成分(阿膠化學成分信息來自TCMID,其余三味中藥成分信息來自TCMSP),并根據成分的藥代動力學(Absorption and distribution and metabolism and excretion,ADME) 參數,口服生物利用度(Oral bioavailability,OB) ≥30% 和類藥性(Drug likeness,DL) ≥0.18 為篩選條件進行檢索,得到壽胎丸生物活性成分,檢索時間為2019 年5 月16 日。

1.2 壽胎丸作用靶點預測 基于上述所篩選的生物活性成分,從pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫獲得各活性成分的Canonical SMILES 結構式,并將Canonical SMILES 結構式導入 SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/) 數據庫,限定物種為“homo sapiens”,獲取成分靶點［15］。SwissTargetPrediction 數據庫目前收錄了3 個不同物種的三千多種蛋白質及其37 萬已知的活性物質,能有效預測小分子蛋白靶點,具有應用范圍廣,預測速度快等優點,在中藥靶點預測中得到了廣泛應用［16-17］。

1.3 先兆流產相關靶點收集 以 “threatened abortion”“threatened miscarriage” 為關鍵詞,利用TTD (http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)、Genecards (https://www.genecards.org/)、NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 3 個數據庫進行疾病靶點檢索,將檢索結果進行合并,刪除重復靶點,從而獲得先兆流產相關靶點,檢索時間為2019 年6 月20 日。

1.4 基因映射及蛋白-蛋白互作網絡構建 將壽胎丸作用靶點與先兆流產相關靶點通過R 語言軟件(3.6.1 版本)進行映射,得到壽胎丸治療先兆流產的潛在作用靶點(交集靶點),繪制韋恩圖。將交集靶點導入 STRING(https://string-db.org/) 數據庫,限定物種為 “homo sapiens”,置信度得分閾值設為“highest confidence” (＞0.9),以TSV 形式保存結果。此外應用R 語言軟件(3.6.1 版本) 對所得的PPI 進行統計,繪制頻次柱狀圖,篩選核心基因。

1.5 藥物-活性成分-疾病-靶點網絡構建 將“1.4” 項下結果通過Cytoscape3.2.1 軟件繪制藥物-活性成分-疾病-靶點網絡,并對網絡進行分析,網絡圖中節點(node) 為藥物、活性成分、疾病、靶點,邊(edge) 代表以上節點之間的相互關系。

1.6 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析 首先,使用R 語言軟件將1.4 所得潛在作用靶點轉換成entrezID。然后,給R 語言軟件安裝clusterProfiler、bioconductor 等程序包。再運行R 語言得到KEGG 富集分析結果,以條形圖、氣泡圖、通路圖等形式展示,并根據P值判斷富集功能和通路的顯著性,以探究壽胎丸治療先兆流產可能的作用機制。

2 結果

2.1 壽胎丸活性成分篩選 本研究以OB≥30%、DL≥0.18 為限制條件,通過TCMSP 數據庫對壽胎丸4 味中藥進行檢索,得到活性成分分別為菟絲子11 種、桑寄生2 種、續斷8 種,但未收錄阿膠成分信息,其3 種成分來自TCMID (未顯示OB、DL 等ADME 信息,檢索到的3 種成分均統計在內)。表1 為篩選后壽胎丸所含24 個成分信息,經過去重及刪除無Pubchem Cid 后得到15 個。

表1 壽胎丸中活性成分信息（含重復）

2.2 壽胎丸潛在靶點及先兆流產相關靶點收集、映射 從Pubchem 數據庫獲得活性成分的Canonical SMILES 結構式,并將Canonical SMILES 結構式上傳到SwissTargetPrediction數據庫,獲取成分靶點,去重后獲得507 個相應靶點；通過 TTD、Genecards、NCBI 數據庫,以 “ Threatened abortion” “Threatened miscarriage” 為關鍵詞進行檢索,將3 個數據庫檢索結果進行合并,去重后獲得先兆流產相應靶點196 個。將壽胎丸作用靶點與先兆流產相關靶點通R語言軟件映射后,得到交集靶點,繪制韋恩圖,見圖1、表2。應用STRING 數據庫構建PPI 網絡圖,見圖2,網絡中節點36 個,邊數190 條,其中節點代表蛋白(交集靶點),邊代表各蛋白之間相互關系,邊數越多,關聯度越大,將STRING 中下載的tsv 文件用R 語言軟件進行處理,統計并繪制出各蛋白-蛋白相互作用的邊數(前20),見圖3,邊數最多的為STAT3 (24 條邊)、EGFR (21 條邊)、MMP-9 (20 條邊)。即PPI 網絡中核心基因為信號傳導與轉錄激活因子(STAT3)、表皮生長因子受體(EGFR)、基質金屬蛋白酶-9 (MMP-9) 等,核心基因與壽胎丸活性成分有較高的結合活性,其在體內治療先兆流產發揮主要作用。

圖1 壽胎丸治療先兆流產潛在靶點

表2 壽胎丸治療先兆流產潛在靶點

圖2 STRING 數據庫分析蛋白-蛋白的相互作用

圖3 PPI 中的核心基因

圖4 藥物-活性成分-疾病-靶點互作網絡圖

2.3 藥物-活性成分-疾病-靶點互作網絡構建 應用Cytoscape3.2.1 軟件繪制藥物-活性成分-疾病-靶點網絡,見圖4,共包括56 個節點(靶點36 個,活性成分15 個,疾病1個,藥物4 個) 和1 156 條邊。自由度(Degree) 表示在蛋白相互作用網絡中該節點直接相互作用的節點的數目,節點的度越大則參與的生物功能越多,其生物重要性越強。分析結果顯示,有效成分中自由度最高的為β-谷甾醇(βsitosterol) 及槲皮素(quercetin),自由度分別為18、14,靶點KDR (酪氨酸激酶受體)、SLC6A4 (5-羥色胺轉運體基因)、ESR1 (雌激素受體α) 自由度(Degree) 最高,分別為13、10、9,表示其生物學重要性較強。

2.4 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析 經R 語言軟件處理后顯示,交集靶點共富集48 個生物學功能,排名前20 的GO 功能富集見圖5,圓點顏色代表P值功能富集的顯著性,顏色越偏向紅色,P值越小,顯著性越強；圓點大小代表參與該功能的靶點數目,圓點越大,參與該功能靶點越多。由此可知,壽胎丸治療先兆流產主要與體內酶活性調節、基因轉錄、核受體活性、激素受體結合等方面內容有關。

圖5 壽胎丸治療先兆流產潛在靶點的GO 功能富集

將所得的36 個交集靶點使用R 語言程序進行KEGG 通路富集分析,處理后得到35 條通路,顯著性最高的15 條通路見表3,將顯著性排名前15 的通路作條形圖,見圖6,橫坐標表示參與該通路靶點數,顏色表示P值,顏色越偏向紅色,則P值越小,顯著性越高。經分析,36 個交集靶點主要分布于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)、缺氧誘導因子(HIF-1)、雌激素(Estrogen) 等多條信號通路,表明壽胎丸主要活性成分可通過多條信號通路來治療先兆流產,通路間存在著復雜的相互作用關系,多成分、多靶點、相互調節是治療先兆流產的可能作用機制。

表3 靶點通路富集結果（前15 個）

圖6 KEGG 通路富集

3 討論

壽胎丸具有補腎安胎之功,臨床中應用壽胎丸或以壽胎丸為基礎方治療先兆流產具有較好的效果。因此,對壽胎丸治療先兆流產的研究具有重要意義。中醫臨床中以整體觀和辨證論治為指導原則,中藥復方有著多成分、多靶點、相互聯系的特征,網絡藥理學能從整體角度系統分析中藥復方“多成分-多靶點” 的作用機制,可以揭示中藥藥效物質基礎及其分子機制使中醫藥研究從經驗醫學向循證醫學轉變,為研究中藥復方的一種新策略,對現代中藥的研究和開發具有重要意義。臨床研究表明,壽胎丸能明顯改善先兆流產患者陰道流血、腰酸、腹痛等臨床癥狀,促進血清β-HCG、孕酮、雌二醇含量,降低血清IL-17、IL-10 及TNF-α 水平［18-19］,聯合西藥治療早期先兆流產合并絨毛膜下血腫效果優于單純西藥治療組［20-21］,相關Meta 分析顯示壽胎丸治療先兆流產的療效優于單純西藥治療［22］,實驗研究表明,壽胎丸含藥血清可促進人早孕滋養層細胞的增殖活性及侵襲遷移能力,減少細胞凋亡［23］,提高促排卵妊娠大鼠的胚泡著床點數［24］,并通過調節控制性超排卵小鼠子宮內膜Ang 及受體表達,提高COH 小鼠子宮內膜容受性［25］。

本研究根據TCMSP 和TCMID 數據庫獲取壽胎丸全方4味中藥主要活性成分,然后再進行活性成分篩選的,所以篩選后的成分均是主要藥味的主要成分,共收集壽胎丸有效成分15 種,現有的研究大多根據有效成分及靶點與藥材的關聯度來對組方規律進行君、臣、佐、使解釋,活性成分及靶點越多的藥材,在處方中地位越重要,通過本研究中藥-有效成分-靶點-疾病網絡分析,根據自由度排名前8的活性成分中,5 種來源于菟絲子,由此體現出菟絲子的君藥地位。壽胎丸相關靶點507 個,與先兆流產196 個疾病相關靶點,交集后獲得36 個基因,構建PPI 網絡,網絡中核心基因為信號傳導與轉錄激活因子(STAT3)、表皮生長因子受體(EGFR)、基質金屬蛋白酶-9 (MMP-9) 等。研究表明STAT3 作為一種轉錄因子,在各種組織的發育,細胞生長和體內平衡中起著關鍵作用［26］,胎盤發育需要細胞增殖,分化和遷移的精確協調,更需滋養層細胞侵入子宮內膜以建立胚胎血液,STAT3 激活對于滋養細胞的侵襲至關重要［27］,STAT3 亦可以通過增加LIF (白血病抑制因子) 和LIFR (白血病抑制因子受體) 之間的相互作用增強粘附分子的表達,從而提高胚胎植入成功率［28］。EGFR 是表皮生長因子受體家族成員之一,廣泛分布于哺乳動物細胞膜上,是一種參與多種細胞活動的重要信號轉導分子,可通過自分泌、旁分泌和內分泌途徑刺激滋養層細胞的增殖和分化,從而調節胚胎發育和胚胎植入［29］,有文獻報道復發性自然流產患者絨毛滋養細胞中EGFR 表達顯著降低［30］,這可能與EGFR 下調引起滋養層細胞的增殖、遷移和侵襲功能異常有關。MMP-9 在滋養細胞侵襲蛻膜過程中起重要作用,滋養細胞自分泌Mmps,誘導其侵入蛻膜,MMP-9 是滋養層細胞侵入蛻膜的限速酶,能降解蛻膜基底膜和細胞外基質［31］,動物實驗發現MMP-9 水平在流產大鼠模型的血清和脫膜組織中均下降,通過抑制Mmps 與可導致妊娠大鼠子宮內膜蛻膜發育不良、胚胎植入困難等［32］。STAT3、EGFR、MMP-9 等核心基因與壽胎丸活性成分有較高的結合活性,其在體內治療先兆流產可能發揮主要作用。

根據中藥-有效成分-靶點-疾病網絡分析,靶點KDR(酪氨酸蛋白激酶)、SLC6A4 (5-羥色胺轉運體基因)、ESR1 (雌激素受體α) 自由度(Degree) 最高,表示其生物學重要性較強。KDR 酪氨酸蛋白激酶,為VEGF (血管內皮生長因子) 的細胞表面受體,VEGF 及KDR 是胎盤血管生成的重要蛋白,在胎盤、胚胎發育中起重要作用,VEGF 和KDR 的轉錄對于維持妊娠至關重要［33-35］,壽胎丸可以通過增加KDR 含量,激活VEGF/KDR 途徑,調節子宮內的血管生成,從而維持早孕。SLC6A 主要與情感表達相關,有“快樂基因” 之稱,其多態性與強迫癥、人格障礙等相關。雌激素通過雌激素受體(ESR1/ESRα、ESR2/ESRβ) 在胎兒和胎盤發育中起著關鍵作用,并在植入前和妊娠維持過程中起著至關重要的作用,有研究表面ESR1多態性與自然流產和不明原因型復發性流產相關［36-37］。

為了進一步分析壽胎丸活性化合物可能作用于先兆流產的相關基因和信號通路,交集后的36 個基因進行GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析。GO 功能富集分析顯示壽胎丸治療先兆流產主要與體內酶活性調節、基因轉錄、核受體活性、激素受體結合等方面內容有關。KEGG 通路富集分析顯示壽胎丸治療先兆流產可能的信號通路為磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 (PI3K/Akt)、缺氧誘導因子(HIF-1)、雌激素(Estrogen) 信號通路。PI3K/AKT 信號是調節滋養層生長和侵襲的重要途徑［38］,有研究表明,抑制FAK/SRC/PI3K/AKT 途徑引起MMP2 和eNOS 下調,進而抑制人EVT HTR-8/SVneo 細胞(人絨毛外滋養層細胞的體外模型) 的遷移和侵襲,從而影響胚胎著床［39］。血管生成是胎兒和胎盤發育中藥因素,有研究顯示早期自然流產組絨毛組織HIF-1α 水平明顯低于人工流產組,且HIF-1α水平與微血管密度(MVD) 呈正相關,敲除HIF-1 基因后MVD 水平明顯下降,并可導致胎盤血管生成失敗,引起胎盤缺血缺氧［40］,HIF-1α 的表達參與了滋養細胞侵襲和遷移的控制［41］。雌激素是一種類固醇激素,調節哺乳動物體內過多的生理過程,包括生殖、心血管保護、骨骼完整性、細胞內穩態和行為。雌激素通過與不同的ER 結合改變細胞生理功,不但能與核ER 結合,也能與膜ER 結合激活PI3K 信號通路,可以直接或間接地通過一個或多個因素在維持靈長類動物妊娠過程中發揮著極其重要的生理作用［42-43］。

綜上所述,本研究表明壽胎丸治療先兆流產主要的活性成分可能為β-谷甾醇(β-sitosterol)、槲皮素(quercetin)等,這些活性成分通過作用于KDR、SLC6A4、ESR1、STAT3、EGFR 等靶標以及調節PI3K/Akt、HIF-1、Estrogen等信號通路發揮治療作用,壽胎丸治療先兆流產可能通過調節絨毛組織微血管密度、促進子宮內膜血管生成、刺激滋養層細胞的增殖、分化及侵入等生物過程來維持早孕,為后續深入研究壽胎丸治療先兆流產奠定理論基礎。