HPLC 法測定杜仲皮、葉、雄花中8 種成分

劉 錕，王健英，魏 莉，潘穎宜，袁 穎*

(1.上海中醫藥大學中藥學院，上海 201203；2.上海中醫藥大學協同創新中心，上海 201203）

杜仲Eucommiaul moidesOliv.為杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木,是我國特有的常用中藥材。其干燥樹皮藥用,具有補肝腎、強筋骨、安胎等作用［1］,《神農本草經》 將其列為上品,在我國已有兩千多年藥用歷史,但因杜仲樹皮達到藥用的生長周期長,且不可再生等,導致杜仲藥用資源緊缺［2］。現代研究［3-4］表明杜仲富含木脂素、苯丙素、黃酮、環烯醚萜、三萜等成分,具有降血脂、降血壓［5］、降血糖［6］、抗骨質疏松［7］、抗腫瘤［8］、抗菌［9］、抗炎［10-11］等藥理作用,且杜仲不同藥用部位的各成分含量有所差異［12-14］。但課題組尚未見國內外對杜仲皮、葉和雄花3 個藥用部位的成分進行比較的研究報道。故本實驗擬比較杜仲皮、葉、雄花中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、槲皮素和白樺脂酸8 種成分含量的差異,以期為杜仲的質量控制,藥用資源的拓展以及藥理作用的物質基礎的闡述提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 系統,配置四元泵、DAD檢測器、柱溫箱、自動進樣器、色譜工作站、gilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,美國Agilent 公司)；MIKRO 220R低溫離心機(德國MIKRO 公司)；BSA124S 分析天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)；SQP 分析天平(十萬分之一,賽多利斯科學儀器北京有限公司)；SK7200HP 超聲波清洗儀(上海科尋超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 杜仲皮、杜仲葉、杜仲雄花信息見表1,經上海中醫藥大學中藥學院生藥教研室吳靳榮副教授鑒定為杜仲科植物杜仲Eucommiaul moidesOliv.的干燥樹皮、葉、雄花。桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、槲皮素、白樺脂酸對照品(批號分別 為 B21238、B20635、B21661、B20636、B21213、B20782、B20527、B20041,質量分數≥98%,上海源葉生物科技有限公司)；甲醇、甲酸(批號分別為20170812、A117-50,色譜級,國藥集團化學試劑有限公司)；乙腈(批號B9012-03,色譜級,北美J.T.Baker 公司)；水為娃哈哈純凈水。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 用于檢測7 種成分供試品溶液 取干燥杜仲皮、葉打粉,過40 目篩,精密稱取樣品各1.00 g,加入50%甲醇溶液25 mL 并充分混勻,靜置30 min 后再超聲提取30 min,于4 ℃6 000 r/min條件離心3 min 后取上清液經0.22 μm 微孔濾膜過濾,取續濾液即得(4 ℃條件下存放)。精密稱取干燥杜仲雄花(未打粉) 1.00 g,同法制備得供試品溶液。

2.1.2 用于檢測白樺脂酸供試品溶液 取干燥杜仲皮、葉打粉,過40 目篩,精確稱取各樣品1.00 g,加入75% 甲醇25 mL 并充分混勻稱定質量,然后回流提取1 h 并補足減失質量,于4 ℃6 000 r/min 條件離心3 min 后取上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾,再取續濾液即得(4 ℃條件下存放)。稱取干燥杜仲雄花(未打粉) 1.00 g,同法制備得供試品溶液。

2.1.3 對照品溶液 精密稱取桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、槲皮素和白樺脂酸對照品適量,用甲醇制備成含8 種成分的混合對照品溶液,其母液質量濃度分別 為1.558、1.605、0.320、0.282、0.422、1.742、0.445、2.250 mg/mL,溶液經0.22 μm 微孔濾膜過濾,取續濾液即得。

2.2 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相乙腈(A) -0.1%甲酸水溶液(B)；梯度洗脫(0～40 min,5%～15% A；40～50 min,15%～25% A；50～60 min,25%～30%A；60～65 min,30%～5%A；65～80 min,5%～5% A)；白樺脂酸為等度洗脫(0～30 min,82%A)；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；進樣器溫度4 ℃；進樣量10 μL；檢測波長194、202、238、320、368、210 nm。8 種混合對照品及杜仲皮、葉、雄花樣品HPLC 色譜圖,見圖1～6。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 取“2.1.3” 項下8 種混合對照品貯備液,用甲醇適當稀釋成不同的質量濃度,在“2.2” 項條件下進樣,以對照品質量濃度為橫坐標(X),色譜峰面積為縱坐標(Y) 進行回歸,結果見表2,表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

圖1 桃葉珊瑚苷HPLC 色譜圖（λ=194 nm）Fig.1 HPLC chromatograms of aucubin （λ=194 nm）

圖2 松脂醇二葡萄糖苷色譜圖（λ=202 nm）Fig.2 HPLC chromatograms of pinoresinol diglucoside （λ=202 nm）

圖3 各成分HPLC 色譜圖（λ=238 nm）Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents （λ=238 nm）

圖4 綠原酸HPLC 色譜圖（λ=320 nm）Fig.4 HPLC chromatograms of chlorogenic acid （λ=320 nm）

2.3.2 精密度試驗 取“2.1.3” 項下8 種混合對照品貯備液,在“2.2” 項條件下連續進樣6次,第2 天再連續進樣6 次,分別記錄峰面積,計算得桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、槲皮素、白樺脂酸的日內峰面積RSD 分別為2.07%、1.88%、0.70%、0.54%、1.67%、0.66%、0.98%、0.14%；日間峰面積RSD 分別為2.53%、1.31%、0.42%、0.44%、1.83%、0.49%、0.36%、1.59%,表明儀器日內、日間精密度均良好。

圖5 槲皮素HPLC 色譜圖（λ=368 nm）Fig.5 HPLC chromatograms of querctin （λ=368 nm）

圖6 白樺脂酸HPLC 色譜圖（λ=210 nm）Fig.6 HPLC chromatograms of betulinic acid （λ=210 nm）

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 穩定性試驗 取“2.1.1” “2.1.2” 項下供試品溶液,在“2.2” 項條件下,分別于0、4、8、12、24、36 h 進樣,記錄峰面積,計算得桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、槲皮素、白樺脂酸RSD 分別 為 3.0%、0.38%、1.73%、2.74%、1.04%、1.11%、1.60%、2.89%,表明供試品溶液在36 h內穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗 精密稱取同一批樣品,分別按“2.1.1” “2.1.2” 項下方法制備7 種成分和白樺脂酸的供試品溶液6 份,在“2.2” 項條件下進樣,記錄峰面積,計算得桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、槲皮素、白樺脂酸含量RSD 分別為2.69%、1.18%、2.14%、1.39%、2.27%、0.90%、1.16%、2.38%,表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取同一批含量已知的樣品,精密加入桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、槲皮素、白樺脂酸(質量濃度分別為1.122、1.933、0.274、0.449、2.623、0.504、0.414、1.134 mg/mL)的對照品溶液各0.27、0.3、0.31、0.34、0.33、0.36、0.28、0.25 mL；0.54、0.6、0.62、0.68、0.66、0.72、0.56、0.50 mL；0.81、0.9、0.93、1.02、0.99、1.08、0.84、0.75 mL,并使得加入樣品的溶劑總體積為25 mL,分別按 “2.1.1”“2.1.2” 項下方法制備7 種成分和白樺脂酸的供試品溶液9 份,在“2.2” 項條件下測定,記錄峰面積,分別計算8 種成分50%、100%、150%水平的平均加樣回收率。結果,桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、槲皮素和白樺脂酸平均加樣回收率分別為100.90%、103.58%、100.75%、97.70%、104.33%、95.75%、95.02%、101.79%,RSD 分別為1.49%、0.35%、1.00%、1.37%、0.63%、0.28%、0.99%、1.96%。

2.4 樣品含量測定 精密稱定杜仲皮、葉、雄花各1.00 g,分別按“2.1.1” “2.1.2” 項下方法制備7 種成分和白樺脂酸的供試品溶液各6 份,在“2.2” 項色譜條件下測定,記錄峰面積。表3、圖7 表明,杜仲皮、葉、雄花中8 種成分的含量存在差異,桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、白樺脂酸的含量由高到低次序為雄花＞葉＞皮,綠原酸含量高低次序為葉＞雄花＞皮,而京尼平在杜仲皮中含量最高,且松脂醇二葡萄糖苷只在皮中檢出。

表3 各成分含量測定結果（n=3，mg/g）Tab.3 Results of content determination of various constituents （n=3，mg/g） ）

圖7 杜仲皮、葉、雄花中8 種成分含量Fig.7 Contents of eight chemical constituents in the bark，leaves and male flowers of E.ulmoides

3 討論

杜仲所含化學成分種類繁多,以單一成分評價杜仲的成分差異或作為質量控制標準有所欠缺。故本實驗選擇8 種指標成分,分別代表杜仲中黃酮、環烯醚萜、木脂素、苯丙素、三萜類5 種主要有效成分［7-8］。當所檢成分極性差距大的情況下,采用同一方法對成分進行提取和檢測,可能會導致較大的結果誤差。本實驗所檢測8 種成分中,考慮到白樺脂酸極性與其他7 種成分相差較大,故參照2020 年版《中國藥典》 及文獻［15］,采取單因素考察,并進行多波長檢測后采集光譜數據分析,后決定將白樺脂酸提取及洗脫方式區別于其他7 種成分,所得結果良好。

杜仲皮中松脂醇二葡萄糖苷和京尼平含量最高,而杜仲葉及雄花中未檢測到松脂醇二葡萄糖苷,這主要因為木脂素類成分主要存在于植物的木部和樹脂中,故《中國藥典》 將松脂醇二葡萄糖苷作為杜仲皮的質量標準。杜仲雄花中環烯醚萜類成分桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、京尼平苷含量以及三萜類白樺脂酸含量均明顯高于皮和葉,表明萜類可能是杜仲雄花的主要成分,可將雄花中的桃葉珊瑚苷和白樺脂酸作為評價其藥材質量的指標成分。杜仲葉中苯丙素類成分綠原酸含量最高。雖然有研究認為杜仲黃酮是杜仲的主要有效成分,但本次檢測中槲皮素在3 個藥用部位含量都很少,提示如果要對杜仲黃酮作進一步研究,還應選擇杜仲中其他黃酮類成分進行分析。

同一部位不同批檢測結果顯示,桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、白樺脂酸含量呈現出較大的離散度,其他成分則相對穩定。桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、白樺脂酸主要存在于杜仲雄花和葉中,除了藥用部位本身造成的主要差異外,產地、采收時間等因素也會對成分含量造成影響,這與文獻［16-18］ 報道一致。

4 結論

本研究建立的方法高效靈敏、操作簡單,能夠準確描述杜仲3 個藥用部位中8 種成分的含量特征。杜仲皮松脂醇二葡萄糖苷、京尼平含量最高；杜仲葉綠原酸含量最高；杜仲雄花中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、京尼平苷、白樺脂酸含量最高,其中桃葉珊瑚苷和白樺脂酸或可作為杜仲雄花質量控制的指標成分。以期本實驗結果為杜仲資源的進一步開發和利用提供實驗基礎,且能更全面評價其藥材質量,為后續杜仲藥效物質基礎研究提供參考。