基于PK15細胞的豬圓環病毒2型全懸浮培養工藝

王嘉琪，董育紅，姜菊玲，錢建寧，魏文濤，宋國亮，焦金波，關新新，姬郭彪，張業炘

基于PK15細胞的豬圓環病毒2型全懸浮培養工藝

1甘肅健順生物科技有限公司，蘭州 730070；2洛陽惠中生物技術有限公司，河南洛陽 471000

【】篩選1株適合PCV2病毒生產的懸浮細胞株，摸索PCV2懸浮生產工藝（病毒種毒來源、MOI及收獲時間），為大規模懸浮培養技術制備疫苗提供試驗依據。使用有限稀釋法對PK15原細胞稀釋后接種于96孔板，每2 d觀察細胞生長和形態，待細胞90%長滿后，將細胞從96孔板陸續擴至24孔板、12孔板、6孔板，最后到方瓶，篩選3株可貼壁生長的、形態較好的PK15克隆。3株克隆（PK15-1C8、2F11、1E5）按照1×106細胞/mL的密度，直接接種在PK15的無血清培養基中，并置于37℃，5%二氧化碳，120 r/min的搖床培養箱中繼續培養，每天監測細胞密度和活率，每3 d傳代，使細胞逐漸適應懸浮環境，馴化為可全懸浮、無血清培養的懸浮細胞株；細胞傳代穩定并建庫后，接種PCV2病毒，通過對比3株懸浮克隆細胞培養PCV2病毒含量的差異，篩選1株克隆細胞，用于生產PCV2；針對不同種毒（來源于貼壁細胞或懸浮細胞），摸索感染MOI（0.1、0.2、0.5）及收獲時間（48、72、96、120h），確定PCV2最佳生產工藝。（1）貼壁細胞置于無血清培養基中，適應至第2代時細胞即可呈懸浮生長，連續傳至11代，細胞生長穩定，按照1×106/mL接種細胞，細胞生長72h時細胞密度可達到10×106/mL，活率在95%以上，倍增時間為20h左右；（2）3株懸浮細胞使用相同條件，分別接種PCV2病毒后，PK15-1C8克隆細胞的病毒含量可達到106.4TCID50/mL，克隆PK15-2F11（105.5TCID50/mL）、PK15-1E5（105.6TCID50/mL），3株克隆細胞病毒含量均高于原克隆（104.7TCID50/mL），但PK15-1C8克隆細胞的病毒含量更高且更穩定，確定為后續研究用細胞；（3）使用貼壁細胞來源的種毒（106.4TCID50/mL）感染PK15-1C8克隆細胞后，最優工藝為接毒時細胞密度1×106/mL，以0.1MOI接毒，接毒后72h收獲，最高病毒含量為106.5TCID50/mL。以來源于懸浮細胞的種毒（106.3TCID50/mL）感染細胞后，病毒含量較貼壁細胞來源種毒更高，最高可達107.3TCID50/mL，其最優工藝為接毒時細胞密度1×106/mL，以0.2MOI接毒，接毒后72h收獲。通過對PK15細胞進行單克隆篩選，馴化懸浮、3株懸浮細胞接種PCV2后病毒含量的對比，確定一株病毒含量最高的懸浮細胞，并以此懸浮細胞為基礎進行PCV2生產工藝摸索，建立了全懸浮無血清培養的PK15-1C8細胞增殖PCV2工藝，該工藝首次使用懸浮細胞擴增PCV2病毒為種毒進行接毒，最高病毒含量可達107.3TCID50/mL，可用于工廠化疫苗生產。

PK15細胞；豬圓環病毒2型；克隆篩選；懸浮培養

0 引言

【研究意義】豬圓環病毒病（porcine circovirus diseases, PCVDs）是影響養豬業的重要傳染病，其病原為豬圓環2型（porcine circovirus type 2, PCV2）。PCV2可引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合癥，還與皮炎腎病綜合癥、增生性壞死性肺炎、豬繁殖與呼吸綜合征、仔豬傳染性先天性震顫等多種疾病相關，但臨床上以多系統衰竭綜合癥最為常見[1-6]，是嚴重危害養豬業健康發展的疫情之一[7-8]。豬腎細胞（PK15）是目前用于PCV2病毒培養的主要細胞系，用于增殖PCV2和制備豬疫苗。但由于PCV2病毒的編碼區非常有限，對宿主細胞具有高度的依賴性[9]，且在PK15細胞系不同的細胞株上增殖的病毒含量不同, 難以達到制備疫苗的要求[10-12]，是制約PCV2全病毒滅活苗的技術瓶頸之一。同時PK15細胞貼壁培養時存在需要血清、放大困難和成本高等問題，需篩選出一株對PCV2敏感，且易于放大和產業化生產的病毒培養工藝。【前人研究進展】PK15細胞現已廣泛應用于豬圓環病毒，但由于PCV2毒力弱，且不產生細胞病變，獲得高病毒含量PCV2難度較大，加之PK15細胞貼壁培養時存在血清，而且放大困難，成本高等問題，因此PCV2的培養病毒含量高低已成為制約現有疫苗質量的關鍵瓶頸之一[13-14]。劉俊斌等[15-18]報道了使用片狀載體和微載體在生物反應器中培養PK15貼壁細胞并感染PCV2的工藝研究，通過優化微載體使用濃度、細胞接種密度、細胞初始攪拌方式、生長階段攪拌速度、培養基補給方式、接毒劑量和收獲時間等關鍵技術參數，提高PCV2產量，確定了反應器生產PCV2的最佳工藝；彭伍平等[19-21]報道了通過篩選貼壁單克隆，找到一株對PCV2敏感的克隆株，從而提高了PCV2病毒含量；劉天倫等[22-23]報道了經貼壁降血清、低血清懸浮優化傳代、無血清懸浮傳代培養，對一株貼壁PK15細胞進行了無血清全懸浮馴化，并可穩定傳代，以期為傳代細胞系低血清馴化培養及圓環病毒在低血清培養細胞上的增殖研究奠定基礎；李雨慈[24]報道使用昆蟲細胞基因表達技術，首次使用懸浮培養生產的豬圓環病毒病疫苗；郭玲花等[25-28]報道了豬圓環病毒2型懸浮培養工藝的研究進展，對目前國內外市場上PCV2疫苗的制備工藝及其優缺點進行對比分析，可利用全懸浮培養工藝培養PK-15細胞來增殖PCV2；此外，未見全懸浮培養工藝中以懸浮細胞制備種毒的研究報道。【本研究切入點】篩選出1株PCV2高產克隆細胞株，并建立起無血清全懸浮病毒培養工藝。【擬解決的關鍵問題】通過全懸浮細胞培養技術，制備出病毒含量高和適合豬圓環病毒病滅活疫苗規模化生產工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗時間和地點 試驗于2018年12月至2019年12月在甘肅健順生物科技有限公司實驗室進行。

1.1.2 細胞株 試驗所用細胞株為PK15（豬圓環病毒1型及2型陰性）[PK15, PK-15]ATCC? CCL-33?，甘肅健順生物科技有限公司保存。

1.1.3 病毒株 PCV2（豬圓環2型病毒分離株，PK15貼壁獲得P14病毒，病毒含量106.4TCID50/mL，支原體檢驗、BVDV、CSFV、致細胞病變檢查及紅細胞吸附性外源病毒檢驗均為陰性）由洛陽惠中生物技術有限公司提供。

1.1.4 主要試劑和耗材 DMEM高糖、CD PK15 259（PK15懸浮細胞生長培養基）、PK15接毒培養基、0.25%胰蛋白酶-EDTA、接毒培養基A、接毒培養基B（以上試劑均由甘肅健順生物科技有限公司提供），FBS（蘭州榮曄生物科技有限公司），PCV2一抗、羊抗鼠二抗（南京華恩生物科技有限公司），熒光顯微鏡（OLYMPUS），Vi-Cell細胞計數儀。

1.2 方法

1.2.1 貼壁PK15細胞克隆 采用有限稀釋法，將細胞鋪于96孔培養板，于37℃、5%CO2培養箱中培養，第4天于顯微鏡下初步挑選單克隆，每兩天顯微鏡下觀察，保證孔中細胞為單克隆團，將克隆細胞逐步放大培養。

1.2.2 克隆細胞株懸浮馴化 待細胞擴大至T225瓶時，消化，計數，離心，采用PK15懸浮生長培養基CD PK15 259按1.0×106個細胞/mL密度重懸細胞，并于37℃、5%CO2搖床培養箱中培養，至細胞適應懸浮培養基可正常生長。

1.2.3 PCV2高產細胞篩選 待馴化懸浮的PK15-2F11、1E5、1C8細胞生長至第3天時，分別使用PK15接毒培養基A和PK15接毒培養基B將細胞稀釋至1.0×106個細胞/mL，工作體積30mL分別接于125mL搖瓶中，按體積比5%加入PCV2病毒，37℃、5%CO2于搖床培養箱中培養，每天取樣計數，72h后收毒，采用測定病毒含量。并將收獲病毒液，對應細胞第二次感染各克隆細胞。

1.2.4 接毒工藝優化 接毒培養基A將培養至第3天的PK15-1C8細胞稀釋至1.0×106個細胞/mL，按0.1、0.2、0.5MOI（PCV2來源于貼壁細胞毒）接毒，試驗重復3次，或按0.1、0.2、0.5MOI（PCV2來源于懸浮細胞毒）接毒，試驗重復5次，不同時間段收獲病毒液，測定病毒含量（表1）。

1.2.5 病毒含量測定 用含2%血清的DMEM培養基將所取病毒液作10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-74個稀釋度，分別接種在單層PK15細胞的96孔細胞培養板中，每個稀釋度接種6孔，100μL /孔，同時設正常細胞對照組，采用Reed-Müench法計算TCID50。

2 結果

2.1 PK15單克隆細胞馴化懸浮

將挑出來的4個單克隆貼壁細胞及PK15原細胞株馴化懸浮，成功馴化3株克隆和PK15細胞，細胞生長曲線如圖1所示，PK15、PK15-2F11和1C8 3株細胞均1代便從貼壁細胞馴化為懸浮細胞，且細胞生長穩定，PK15-1E5前5代生長較慢，6代后細胞生長變快漸漸生長穩定。4株細胞生長穩定之后，3d生長情況相似，密度幾乎都為10×106個細胞/mL，PK15、PK15-2F11、1E5、1C8細胞倍增時間為分別為21、21、20和21 h。

2.2 PCV2敏感細胞株篩選

將PK15細胞及PK15-2F11、PK15-1E5、PK15-1C8 4株細胞感染PCV2（種毒由懸浮細胞獲得），TCID50結果如圖2-A所示，3株克隆細胞毒價均高于原始細胞株，PK15-1C8試驗組較其他2株克隆細胞毒價更高，病毒含量為106.0TCID50/mL，使用接毒培養基A接毒組（PK15-1C8-C1）與使用接毒培養基B接毒組（PK15-1C8-C2）病毒含量無差異。為了檢測第一次試驗結果的可靠性，將第一次所收獲病毒液，對應細胞株進行第二次接毒（圖2-B），3株克隆細胞感染PCV2后仍然是PK15-1C8更高，是2F11、1E5的10倍，病毒含量維持在106.0TCID50/mL。

表1 接毒工藝優化試驗參數

A.PK15細胞馴化生長曲線。B.PK15-2F11細胞馴化生長曲線。C.PK15-1E5細胞馴化生長曲線。D. PK15-1C8細胞馴化生長曲線。其中，實線為細胞生長密度曲線，虛線為細胞活率曲線。淺色線為3種單克隆和PK15貼壁細胞生長曲線，深色線條為3種單克隆和PK15細胞馴化懸浮細胞生長曲線。

A.PK15、PK15-2F11、PK15-1E5、PK15-1C8四株細胞分別感染PCV2后TCID50。B.PK15-2F11、PK15-1E5、PK15-1C8三株細胞分別對應感染圖A收獲PCV2病毒。其中，C1為使用接毒培養基A接毒實驗組，C2為使用接毒培養基B接毒實驗組。

2.3 接毒工藝優化

2.3.1 貼壁細胞收獲病毒為感染種毒工藝優化 如表1所示進行試驗，不同MOI感染細胞重復3次試驗后，3種不同MOI感染的細胞毒價差異不大均在106.5TCID50/mL左右（表2），因此選取病毒添加較少的0.1MOI接毒。

選取接毒計量(MOI)為0.1的感染條件，于培養48、72、96、120 h取樣，檢測病毒含量，綜合3次試驗結果72 h收獲病毒含量lgTCID50/mL較高且更穩定。

表2 不同MOI、不同時間的PCV2感染PK15-1C8病毒含量

2.3.2 懸浮細胞收獲病毒為感染種毒來源相關工藝確認 接毒計量及收毒時間摸索, 如表3所示，分別按0.1、0.2、0.5MOI將由懸浮PK15細胞所獲PCV2病毒感染PK15-1C8細胞，0.2MOI感染后，病毒含量更穩定。因此當種毒來源于懸浮細胞時，0.2MOI接毒更佳。

以0.2MOI的接毒量，相同試驗方法接毒，檢測48、72、96 h病毒含量。48 h病毒含量低于72與96 h，但72與96 h病毒含量差異不大，從病毒含量和生產的時間效率考慮，以懸浮細胞制備的病毒為種毒，接毒量為0.2MOI 72h收獲更佳。

表3 不同MOI、不同時間的PCV2感染PK15-1C8病毒含量

3 討論

PK15細胞作為PCV2主要感染細胞，廣泛應用于PCV2疫苗的生產，但由于PCV2 DNA的合成依賴于細胞周期S期表達的酶，隨宿主細胞的復制而復制，因此病毒的復制周期更長，使得PCV2體外增值能力較差[29-31]。彭伍平等[19-21]通過對PK15貼壁細胞進行有限稀釋后，挑選出的單克隆細胞表現出了對PCV2的高敏感性，提示我們可以通過該方法提高病毒產量，但貼壁細胞生產放大采用的細胞工廠或轉瓶工藝，勞動強度大，可使用的細胞密度低[18]，而微載體技術雖然可以有效提高細胞密度，但仍存在生產成本高等弊端，且血清的使用對產品的可控性、安全性、批間差產生一定影響[22-23]。而懸浮培養細胞，可以在較小的空間內達到較高的細胞密度，同時無血清培養基的使用，使得細胞培養成本低、產品可控、重復性高。因此本文采用有限稀釋法挑選出單克隆細胞，并將其馴化懸浮，篩選出對PCV2高敏感的PK15懸浮細胞，以期解決PCV2在生產中病毒含量低的問題。同時通過查閱文獻發現，病毒感染時補料的添加、不同感染MOI及收獲時間也是影響病毒產量的原因[16,32]，因此在挑選出單克隆懸浮細胞的基礎上，進一步進行了工藝優化，確定了最佳的病毒感染MOI及收獲時間。

劉天倫等[22]的研究，通過貼壁細胞逐漸降血清，到懸浮細胞低血清，再到懸浮細胞無血清的過程，經過了23代傳代，將PK15貼壁細胞馴化為懸浮細胞，懸浮細胞72h最高生長密度為4.0×106/mL。而本文通過將貼壁PK15使用有限稀釋法稀釋獲得單克隆細胞，并從貼壁細胞含10%血清直接馴化為懸浮無血清，馴化后第二代即可高密度生長，細胞生長穩定，以3d按1﹕10的比例進行擴大，生長密度可達到10× 106/mL，活率均在95%以上。相較劉天倫[22]等的研究，本文細胞馴化時間更短，且馴化懸浮后的細胞生長穩定倍增時間短，可大大縮短生產周期，為工業的放大生產提供有力支持；同時本文對懸浮細胞進行了單克隆篩選，篩選出的克隆細胞PCV2病毒含量較原克隆從105.0TCID50/mL提高至106.5TCID50/mL，可大大提高PCV2病毒疫苗的生產效率，但該懸浮克隆細胞PCV2病毒產量仍未達到理想結果，因此我們進一步進行了工藝優化。

福州大北農與成都天邦開發的DBN-SX07 株滅活疫苗，滅活前半成品病毒含量105.5TCID50/mL以上；武漢中博，科前生物等開發的WH株滅活疫苗，滅活前半成品病毒含量在107.0TCID50/mL以上；江蘇南農高科等開發的SH株滅活疫苗，滅活前半成品病毒含量在106.0TCID50/mL以上；哈維科等開發的LG株滅活疫苗,滅活前半成品病毒含量105.5TCID50/mL以上[33]。為了進一步提高該PCV2敏感克隆懸浮細胞的病毒產量，針對該細胞進行了接毒工藝的摸索，確定了不同種毒（來源于貼壁細胞或者懸浮細胞）來源接毒MOI及收獲時間，結果發現，使用懸浮細胞種毒、按照0.2MOI接毒72h收獲病毒含量從106.5TCID50/mL提高至107.3TCID50/mL；較傳統貼壁工藝和現有的無血清培養基工藝[15-17,23]相比，收獲時間縮短，接毒劑量低且首次接種懸浮細胞制備的種毒，病毒含量提高了10倍，可提高生產效率，縮短生產周期，同時整個生產工藝采用無血清培養，降低生產成本和純化難度，提高產品質量和批間一致性。此工藝經過多次試驗驗證，確定了工藝的穩定性，為后期的PCV2病毒疫苗的研究和生產奠定了基礎。

4 結論

本研究通過細胞克隆、懸浮馴化、高產細胞株篩選及PCV2生產工藝摸索，建立了全懸浮無血清培養的PK15-1C8細胞增殖PCV2工藝，為疫苗企業采用無血清懸浮培養工藝提供了試驗依據。

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Based on PK15 Cell Line for PCV2 Fully Suspension Culture Process

WANG JiaQi1，DONG YuHong1，JIANG JuLing1，QIAN JianNing1，WEI WenTao1，SONG GuoLiang2，JIAO JinBo2，GUAN XinXin2，JI GuoBiao2，ZHANG YeXin1

1Gansu Jianshun Biotechnology Co., Ltd, Lanzhou 730070;2Luoyang Huizhong Biotech Co.,Ltd., Luoyang 471000, Henan

【】Selected one suspension PK15 cell line which is suitable for PCV2 virus , and then developed the production process for PCV2 vaccines(source of virus, MOI and harvest time ), to provide basic theory and guarantee for large-scale production use suspension culture instead of adherent culture.【】The PK15 primary cells were diluted using the limiting dilution method and seeded in 96-well plates. The cell growth and morphology were observed every 2 days. After 90% of the cells were overgrown, the cells were gradually expanded from 96-well plates to 24-well plates，to 12-well plates, to 6-well plate, and finally to the square flask, three PK15 clones with good morphology that can grow adherently were selected. Three PK15 clones with good morphology that can grow adherently were selected. Three clones (PK15-1C8, 2F11, 1E5) were directly seeding in PK15 serum-free medium at a density of 1×106cells/mL and placed in a shaker incubator at 37 ℃, 5% carbon dioxide, and 120 r/min to continue culture. Monitor the cell density and viability every day, passage every 3 days, make the cells gradually adapt to the suspension environment, the PK15 clone can culture as a fully suspension cell line and can growth well in serum free media. After suspension cells stability passage and cell bank, compared the PCV2 virus content with three suspension clone cells, one clone cell was selected for PCV2 production. For different kinds of viruses (source from adherent cells or suspension cells), explore the infection MOI (0.1, 0.2, 0.5) and harvest time (48, 72, 96, 120h), determine the best production process of PCV2.【】(1)The results showed that when the adherent cells passage to second generation in serum media CD PK15 259, the cells can suspended growth, continuous passage for eleven generation, suspension cells can growth stable, when seeding with 1×106/mL cells, cells can reach 10×106/mL cells when growth at 72h, viability rate is above 95%, and the doubling time is about 20h; (2) The three suspension cells use the same condition to infection PCV2 virus, the virus content of PK15-1C8 cloned cells can reach 106.4TCID50/mL, clone PK15-2F11 (105.5TCID50/mL), PK15-1E5 (105.6TCID50/mL), the virus content of the three cloned cells was higher than that of the original clone (104.7TCID50/mL), however, the virus content of PK15-1C8 cloned cells is higher and more stable, so it is determined as a cell for follow-up research; (3) After infecting PK15-1C8 cloned cells with seed virus (106.4TCID50/mL) from adherent cells, the optimal process is 1×106/mL cell density with 0.1MOI and harvest at 72h the virus content can reach 106.5TCID50/mL. After infecting PK15-1C8 cloned cells with seed virus (106.3TCID50/mL) from suspension cells, the optimal process is 1×106/mL cell density with 0.2MOI and harvest at 72h the virus content can reach 107.3TCID50/mL. 【】Through the monoclonal screening of PK15 cells, adapted to suspension cells compared the PCV2 virus content of 3 suspension cells, a suspension cell with the highest virus content was determined, and based on this suspension cell, explored the process of PCV2 virus, and then established the PCV2 fully suspension, serum-free culture process. The SV15-1C8 cell proliferation PCV2 process of full suspension serum-free culture was established. This process used suspension cells to amplify PCV2 virus for seed poisoning for the first time. The highest virus content can reach 107.3TCID50/mL, which can be used for factory vaccine production. According selection sensitive clones and optimized the process for PCV2, can increase the virus titer, and realizes full suspension culture without serum, improved the production process of PCV2, improve the production efficiency, reduce the cost and improve the quality of the production. This process first use suspension cells to amplify the PCV2 virus. The highest virus content can reach 107.3TCID50/mL, which can be used for large-scale PCV2 virus production.

PK15 cells; PCV2; clone selection; suspension culture

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.06.017

2020-03-20；

2020-06-30

蘭州市2019年度重點人才項目

王嘉琪，E-mail：wangjiaqi@jianshunbio.com

（責任編輯 林鑒非）