一株高效煙堿降解內生菌的分離及降解特征研究

林智慧 鄧新發 王雪仁 蘇丹 封磊 宋萍

摘? 要：為了解煙草內生菌的煙堿降解機制，以一株具有高效煙堿降解功能的內生菌G16為對象，通過降解培養及代謝產物分析，對其煙堿降解特征進行研究。結果表明，該菌株經鑒定為Rhizobium sp.G16，在煙堿培養基中的生長符合Slogistic模型，煙堿對G16菌株的最大生長抑制濃度為4000 mg/L;G16菌株的煙堿降解受到pH、接種量及煙堿濃度的影響，其降解過程可采用一級動力學模型進行描述;對G16菌株降解煙堿的中間代謝產物進行分析，發現主要為尼古丁提林、3-（3， 4-dihydro-2H-pyrrol-5-yl）pyridine、脫甲基尼古丁、2，3-聯吡啶、可鐵寧等物質。

關鍵詞：煙堿;內生菌;降解特征;動力學;中間產物

Abstract： In order to understand the nicotine-degrading mechanisms of tobacco endophytes， an endophytic bacterial strain G16 with a high efficiency nicotine-degrading capability was chosen， and its nicotinedegrading characteristics were studied through the methods of nicotine degradation culture and metabolite analysis. The results showed that the strain G16 was identified as Rhizobium sp.G16 and its growth in nicotine medium could be fitted well by the Slogistic model. The growth inhibition concentration of nicotine for strain G16 was 4000 mg/L. The nicotine degradation capability of strain G16 was affected by pH value， inoculation amount of bacterium， and nicotine concentration of broth. Moreover， the results of metabolite analysis by GC-MS showed that the intermediate products of G16 nicotine degradation included nicotyrine， 3-（3，4-dihydro-2H-pyrrol-5-yl） pyridine， nornicotine， cotinine， and so on.

Keywords： nicotine; entophyte; degradation characteristics; dynamics; intermediate product

煙堿又稱尼古丁，是煙草生物堿的主要成分，也是衡量煙草品質的重要指標[1]。我國是煙草生產大國，所產煙葉在外觀質量上已接近或達到先進產煙國的標準，但其內在品質還存在一定的差距，其中一個重要的原因就是上部煙葉中煙堿含量普遍過高，影響了煙葉質量和工業可用性[2]。因此如何降低上部煙葉中的煙堿含量，已成為煙草行業急需解決的問題。

截止目前，國內外相關學者已在品種選育、農業種植、物化處理、生物降解等多個領域就如何降低煙葉中煙堿含量進行了大量研究[3-6]，雖然取得了一定的進展，但種植煙葉質量受困于煙堿含量這一問題仍然沒有得到有效解決。近年來，隨著研究的不斷深入，一些具有煙堿降解功能的煙草內生菌被陸續發現，并引起了研究者的廣泛關注。如李天麗[7]從陳化煙葉中分離得到具有降解煙堿活性的混合菌群，并通過液體發酵培養對該混合菌群的煙堿降解行為進行了研究;趙麗萍等[8]從62個煙葉樣品中篩選出一株煙堿降解內生細菌，該菌在煙堿質量分數為1‰的培養基中培養54 h后，其最高降解率為98.76%;米其利[9]則從曬煙調制期煙葉中分離出一株Pseudomonas sp.L16，將該菌株的發酵液噴灑在煙葉表面不但能有效降低煙葉中煙堿含量，還會使煙葉的內在化學成分更加協調。然而，目前有關內生菌降解煙堿方面的研究尚處于初始階段，所涉及內容也多集中在分離鑒定及田間施用方面，關于煙草內生菌對煙堿降解機制方面的研究，則罕見報道。而了解這些內生菌的煙堿降解機制，對進一步探究該類菌株在煙草體內煙堿生物合成過程中的功能作用具有重要意義。

本研究以一株從福建三明煙區篩選的高效煙堿降解內生菌為對象，對其生長及煙堿降解特征進行研究，其研究成果對于揭示煙草內生菌的煙堿降解機制，促進植物內生菌在煙草領域的實際應用具有一定的參考價值。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試煙草植株：供試煙草植株于2019年5月采集于福建省煙科所三明市分所沙陽田間試驗場，品種為云煙87。

主要試劑：煙堿（分析純，質量分數97%），購自羅恩公司;煙堿標準品（色譜級，HPLC≥98%），購自麥卡希;甲醇（色譜級，質量分數≥99.99%），購自阿拉丁公司;磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀純度均為色譜純，其他試劑均為AR級試劑。

煙堿培養基：K2HPO4·3H2O 13.3 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，微量元素溶液（MnSO4·7H2O 0.4 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，FeSO4·7H2O 0.2 g使用0.1 mol/L HCl定容至100 mL）0.5 mL，加水定容至1000 mL，pH為7.0，于121 ℃滅菌20 min[10]。煙堿滅菌后經0.22 μm濾膜過濾，備用。上述煙堿培養基中加入18 g瓊脂即為煙堿固體培養基。

1.2? 降煙堿內生菌的分離

采用組織分離和平板涂布法分離內生菌[11]。選取健康的煙草植株，對其根、莖、葉進行清洗、消毒。以最后一次清洗的無菌水為空白對照，檢驗其表面消毒效果。將表面消毒的植物組織研磨成勻漿，稀釋涂布在煙堿固體培養基上，30 ℃恒溫培養箱培養3 d。挑取不同形態的單菌落，經多次劃線培養得到純菌。

1.3? 菌種鑒定

1.3.1? 菌株形態特征? 將篩選得到的內生菌挑取至煙堿固體培養基中培養3 d，觀察平板中菌落的生長情況，并在掃描電子顯微鏡下（Phenom ProX

SEM）觀察其形態特征。

1.3.2? 16S rDNA序列測定? 內生菌的DNA純化與16S rDNA測序工作由上海美吉生物公司完成。16S rDNA擴增的通用引物為27F：5'-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3'。PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，25次循環，72 ℃延伸10 min，40 ℃保存。測序結果通過NCBI上的Blast程序進行同源性比對，并利用MEGA6軟件的Neighbor-Joining構建系統進化樹。

1.4? 菌株生長動力學研究

將內生菌種子液按1%的接種量接種至50 mL的煙堿培養基中（pH=7.0，煙堿濃度為500 mg/L），于150 r/min回旋振蕩、30 ℃下恒溫培養30 h，每3 h對培養進行取樣，測定其在600 nm波長下的OD值，利用Slogistic模型對內生菌進行生長曲線動力學擬合[12]，并計算相關的擬合模型參數。

式中：t為時間;和分別表示在時間t時和初始時間的菌株數量;為最大菌數與初始菌數的差值;為菌株達到最大生長速率的時間;為在時間點的最大生長速率;為菌株最大比生長速率;λ為菌株生長的延滯期。

1.5? 菌株生長的抑制濃度測定

分別在煙堿濃度為100、500、1500、2000、3000和5000 mg/L的液體培養基中，接種1%的內生菌種子液，150 r/min、30 ℃下恒溫培養至穩定期后，測定其在600 nm下的吸光值（OD），每個處理3次重復。

1.6? 菌株降解煙堿特性研究

1.6.1? 煙堿濃度測定? 采用高效液相色譜（Thtermo Fisher U3000）測定煙堿濃度[13]。色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×250 mm，5 μm），紫外檢測器，檢測波長為254 nm。流動相為甲醇與0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.5）混合溶液，體積比為60：40，流速0.6 mL/min，進樣量10 μL，柱溫35 ℃。

1.6.2? pH、接種量和煙堿濃度對菌株降解煙堿能力的單因素影響? 將培養24 h的內生菌種子液接種到煙堿培養基中，依次測定pH值為5、6、7、8、9，接種量為1%、2%、5%，煙堿濃度為500、1500、2000、3000 mg/L時菌株的生長及煙堿降解情況，每次都將上一優化結果用于下一因素的優化。

1.6.3? 降解動力學? 將內生菌種子液按1%的接種量接種至50 mL的煙堿培養基中，在pH=7.0，煙堿初始濃度為500、1500、2000、3000 mg/L條件下培養48 h，每6 h進行取樣，測定其在600 nm波長下的OD值，采用一級反應動力學公式（4）對煙堿降解情況進行擬合。

式中，為煙堿的初始濃度（mg/L）;為t時刻體系中煙堿的濃度（mg/L）;k為煙堿降解速率常數（h-1）;t為降解時間（h）。

1.7? 降解產物分析

將內生菌種子液按1%的接種量接種至50 mL的煙堿培養基中（pH=7.0，煙堿濃度為500 mg/L），于150 r/min回旋振蕩、30 ℃下恒溫培養24 h，每6 h進行取樣，測定其在600 nm波長下的OD值，樣品于4 ℃、12000 r/min，離心30 min后獲得上清液。上清液經0.22 μm濾膜過濾后以高純氮氣吹縮至1 mL，用于氣質聯用儀（島津GCMS-TQ8040）檢測[14]。檢測條件為：進樣口溫度為250 ℃，分流模式，SH-Rxi-5Sil MS色譜柱。程序升溫：60 ℃保持2 min，以10 ℃/min速率升溫至280 ℃，保持10 min。質譜條件為：離子源溫度250 ℃，掃描范圍28～500 m/z，載氣氦氣，流速1.0 mL/min。采集完的數據，經過GCMS Postrun Analysis定性處理，檢索譜庫為NIST4譜庫。

2? 結? 果

2.1? 降煙堿功能內生菌的篩選及鑒定

利用煙堿培養基，從煙草根部分離篩選出1株具有高效降解煙堿功能的內生細菌G16（圖1）。該菌株為半透明的淡黃色濕潤菌體，菌落呈現圓凸型，易于挑起，通過掃描電子顯微鏡觀察菌體形態特征，發現菌株G16呈現直桿狀，菌體大小約為0.6～1.0 μm。

通過16S rDNA序列測定，并經Blast程序比對，發現菌株G16與熱帶根瘤菌Rhizobium tropici CIAT 899 （NR-102511.1）的相似度為99%，表明菌株G16為根瘤菌屬，故命名為根瘤菌G16（Rhizobium sp.G16），并且在構建的系統發育樹中，菌株G16也與熱帶根瘤菌Rhizobium tropic處于同一分支（圖2）。同時，菌株G16的16S rDNA測序結果已上傳到GenBank數據庫，注冊登錄號為MN712240。

2.2? 菌株生長動力學研究

采用Slogistic模型對菌株G16在煙堿培養基中的生長過程進行擬合（圖3），相關的擬合參數如表1所示。由表1的數據可知，Slogistic模型的擬合程度較高，R2為0.989，可以較好地描述菌株G16的生長情況。另外，通過該模型預測可知，菌株G16在煙堿培養基中經過16.509 h可達到其最大生長速率，最高菌體生長數量的OD600值為0.173，最大菌體比生長率約為0.016，生長延遲期約為11.059 h。

2.3? 菌株G16的生長抑制濃度

由圖4可知，不同濃度的煙堿會對菌株G16生長產生不同程度的影響，其菌體數量隨著煙堿濃度的增大呈現出先增加后減少的趨勢。當煙堿濃度介于1500～3000 mg/L之間時，G16生長良好，并且當煙堿濃度為1500 mg/L時，菌株G16的細胞生長量最大，而當煙堿濃度增至4000 mg/L時，則該菌株的生長迅速下降，表明煙堿對菌株G16的最小生長抑制濃度為4000 mg/L。

2.4? 菌株G16的煙堿降解特性

2.4.1? pH對菌株G16降解煙堿的影響? 不同pH對菌株G16煙堿降解能力的影響如圖5所示。從圖中可知，在pH值為5.0～8.0范圍內，菌株G16均能取得較高的煙堿降解率，并且當pH值為7.0時，煙堿的降解率最高，為93%。然而，當培養基中pH值超過8.0時，該菌株的煙堿降解能力則明顯受到抑制。

2.4.2? 接種量對菌株G16降解煙堿的影響? 菌株G16接種量對其煙堿降解能力的影響如圖6所示。當接種量為1%、2%、5%、10%時，菌株G16達到其最高煙堿降解率的時間分別為24、24、15和12 h，說明菌體接種量的增加可以顯著提升菌株G16對煙堿的降解速率。然而，經過24 h的培養，對比不同接種量條件下的煙堿最終降解數量，發現并無明顯差異，均可達到約90%左右的降解率，表明菌體接種量對最終煙堿降解率影響不大。

2.4.3? 煙堿濃度對菌株G16降解煙堿的影響? 由于不同菌株對高毒性煙堿耐受程度的不同，其降解能力受煙堿濃度影響的程度也存在著一定的差異。從圖7可以看出，當煙堿濃度為500 mg/L時，菌株G16降解速率最快，在培養24 h后基本降解完全;當煙堿濃度為1500和2000 mg/L，其降解速率較慢，在培養48 h后其降解率分別為92%、89%。當煙堿濃度為3000 mg/L時，則在48 h內無法完全降解，降解率僅為32%。

2.4.4? 降解動力學分析? 采用一級動力學模型對菌株G16的煙堿降解行為進行擬合，相關擬合參數如表2所示。從表中可知，當菌體接種量一定時，菌株G16的煙堿降解速率常數隨著濃度的增大而減小。其相關系數R2為0.88～0.95，說明該模型可以較好的反映菌株G16的煙堿降解情況。

2.5? 降解產物分析

采用氣質聯用儀（GC-MS）對菌株G16在降解煙堿過程中的中間代謝產物進行分析檢測，結果如圖8所示。從檢測結果可以發現，其成分主要包括煙堿（Nicotine，RT=12.303 min）、脫甲基尼古丁（RT=13.326 min）、3-（3，4-dihydro-2H-pyrrol-5-yl） pyridine（RT=13.396 min）、尼古丁提林（RT=14.096 min）、新煙堿（RT=14.286 min）、去氫新煙堿（RT=14.666 min）、2，3-聯吡啶（RT=14.884 min）、2，5，6-trimethyl-1H-benzimidazole（RT=15.356 min）、可鐵寧（RT=16.97 min）和2-cyclohexylidene- cyclohexanone（RT=17.855 min）等物質。

3? 討? 論

植物內生菌是指那些在其生活史中的某一段或全部時期生活在植物組織內，對植物組織沒有引起明顯外觀特征變化的微生物[15]。內生菌長期生活在植物體內環境中并與宿主協同進化，其對宿主植物的生長和生理生化均會產生重要影響。近年來，伴隨著微生物降解煙堿研究的興起，一些具有煙堿降解功能的煙草內生菌被不斷分離出來，而了解這些內生菌的煙堿降解特征及作用機制，有助于揭示該類微生物在宿主煙堿合成過程中所扮演的功能角色。

本研究所篩選的煙草內生菌Rhizobium sp. G16對煙堿的降解率最高可達93%，但其生長情況卻與培養基中的煙堿濃度密切相關，濃度過高或過低均不利于該菌株的生長。而之所以出現這種情況，是由于煙堿作為培養基中唯一的碳源與氮源，當其處于低濃度時，其供給量無法滿足G16的生長，而隨著煙堿濃度的升高，G16獲取了生長所需的營養，菌體數量明顯增加，但當煙堿的濃度超出了G16生長所需，過量的煙堿又會對菌體的生長產生抑制效應。另外，不同煙堿降解菌受pH值的影響也不盡相同，如萬虎等[16]從煙草廢棄物中篩選出一株惡臭假單胞菌P. putida，但該菌株只有在pH為6.5～7.5時才具有較高的煙堿降解活性。而本研究篩選的內生菌G16，在pH值為5.0～8.0范圍內，煙堿降解率均可達到90%上下，擁有更好的酸堿適應能力。

目前，盡管已報道了多株微生物對煙堿的降解途徑，然而由于微生物種類眾多，有關根瘤菌屬（Rhizobium sp.）代謝煙堿的途徑，至今尚未見報道。在Rhizobium sp. G16的煙堿降解中間產物中，脫甲基尼古丁（Nornicotine，產物I）、尼古丁提林（Nicotyrine，產物II）、可鐵寧（Cotinine，產物III）為煙堿常見的代謝產物[17-20]，與Pseudomonas sp.HF-1代謝煙堿的產物有一定的相似性，而新煙堿和去氫新煙堿兩種化合物也是在煙堿降解過程中常見的物質，并且為含量較高的次要生物堿成分。至于3-（3，4-dihydro-2H-pyrrol-5-yl）pyridine，WANG等[21]在研究Pseudomonas sp. CS3的煙堿代謝過程時，也曾檢測到該化合物，并推測其是由煙堿去甲基化而形成的;而2，3-聯吡啶也曾在Pseudomonas sp. Nic22[22]和Sphingomonas sp. TY[14]的煙堿代謝過程中被檢測出來過，但該物質在微生物煙堿代謝中究竟是如何生成的，至今還未見相關的報道。綜上所述，由于Rhizobium sp. G16的煙堿降解中間產物與Pseudomonas sp.菌屬的煙堿降解產物具有較多的重合性，推測二者可能具有類似的煙堿降解途徑。

4? 結? 論

本研究篩選的高效煙堿降解內生菌經鑒定為Rhizobium sp. G16，其生長符合Slogistic模型，降解活性最高抑制濃度為4000 mg/L。菌株G16在pH為5.0～8.0范圍內，降解率均為90%以上，具有較好的穩定性和適應范圍。G16對煙堿的降解速率隨著接種量的增加而增加，但對24 h后煙堿的最終降解程度并無顯著差異。菌株G16為新發現的降煙堿微生物，通過中間產物分析，推測其與Pseudomonas sp.菌屬具有類似的煙堿降解途徑。下一步將繼續對不同階段煙堿降解產物進行檢測及深入分析，以揭示菌株G16的煙堿降解機制。

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