萬壽菊-煙草輪作調理植煙土壤細菌群落結構的作用

黎妍妍 馮吉 王林 付裕 李錫宏

摘? 要：基于大田試驗和Illumina Hiseq擴增子測序技術，分析了萬壽菊-煙草輪作對植煙土壤細菌群落多樣性和結構的影響，旨在為緩解煙草連作障礙提供理論依據。結果表明，萬壽菊-煙草輪作可提高煙株根際土壤細菌群落Sobs、Shannon和Chao 1等多樣性和豐富度指數;提升土壤中酸桿菌門（Acidobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度;促使生防菌（Pseudomonas）、功能菌（Candidatus_Solibacter、Bryobacter和Bradyrhizobium）、降解菌（Massilia、Novosphingobium和Ramlibacter）和根際促生菌（Flavisolibacter）等菌屬比例上升，有利于改善土壤微生態環境、緩解連作障礙。

關鍵詞：萬壽菊;輪作;細菌群落;多樣性

Abstract： The research aims to provide a theoretical basis for alleviating the obstacles of tobacco continuous cropping. Field experiments and amplicon sequencing based on Illumina Hiseq were conducted to explore the effects of marigold-tobacco rotation on the diversity and structure of bacterial communities in tobacco rhizosphere soil. The results showed that marigold-tobacco rotation could greatly improve the Sobs， Shannon， Chao 1 indexes of soil bacterial communities. And， marigold-tobacco rotation can also improve the relative abundance of Acidobacteria and Bacteroidetes， and increase the proportion of biocontrol bacterium genera （Pseudomonas）， functional bacteria genera （Candidatus_Solibacter， Bryobacter and Bradyrhizobium）， degrading bacteria genera （Massilia， Novosphingobium and Ramlibacter） and plant growth promoting rhizobacteria （Flavisolibacter）. In conclusion， marigold-tobacco rotation is strongly conducive to the improvement of soil microecological environment and alleviation of the obstacles of tobacco continuous cropping.

Keywords： marigold; rotation; bacterial community; diversity

煙草是我國重要的經濟作物，屬茄科忌連作的作物。然而，目前連作是我國煙草的主要種植制度，煙草連作面積占總種植面積的30%～60%[1]。長期連作可導致土壤養分失衡[2]和肥料利用率下降[3];化感物質（或潛在化感物質）增多[4];根際微生態失調，土壤中與營養元素循環相關的微生物數量降低，而病原微生物數量增加[5-6];由此形成連作障礙，即使在正常管理情況下也會出現煙草生育狀況變差、產量和品質降低、病蟲害發生加重等問題。

萬壽菊（Tagetes erecta L.）為菊科萬壽菊屬植物，多用于色素提取。近年來的研究表明，萬壽菊與煙草、大豆等作物輪作可有效降低土壤中線蟲的數量，提升線蟲多樣性指數，有利于線蟲群落結構的平衡[7-8];萬壽菊-當歸輪作對土壤真菌群落組成具有顯著影響[9];萬壽菊-煙草套作可提高根際土壤細菌群落多樣性[10]。因此，萬壽菊的不同利用方式在調控土壤微生態方面具有明顯的積極作用。然而，能否通過萬壽菊-煙草輪作來調理植煙土壤細菌群落結構，緩解煙草連作障礙，卻鮮有報道。本研究通過在連作數年的煙田進行萬壽菊-煙草輪作，分析評價土壤細菌群落結構的變化，以期為尋求緩解或克服煙草連作障礙的方法提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 田間試驗設置

試驗于2016—2018年在湖北省恩施州宣恩縣椒園鎮涼風村進行。試驗地煙草連作15年，種植煙草品種為云煙87。試驗包括2個處理，3次重復，共6個小區。處理1：煙草連作（C）;處理2：萬壽菊-煙草輪作（R），即2016—2017年種植萬壽菊、2018年種植煙草。煙草行株距為1.2 m×0.55 m，每小區種植烤煙100株，4月25日移栽。

1.2? 土壤樣品采集

2018年，處理1和處理2中煙草移栽后50 d、100 d時，采用5點取樣法采集煙株根際土壤樣品（與根系結合較緊密的土壤，在4 mm內），分別記作C_50、R_50、C_100和R_100。每個處理3個重復，共計12個土樣。采集后的土樣置于干冰中帶回實驗室，保存于–80 ℃冰箱，用于DNA提取。

1.3? 土壤細菌群落分析

1.3.1? DNA提取及PCR擴增? 采用FastDNA Spin Kit試劑盒（MP Biomedicals， USA）提取土樣總DNA。以樣品DNA為模板，采用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對細菌16S rDNA V4可變區進行PCR擴增。擴增體系（30 ?L）包括：15 ?L Phusion Master Mix Buffer（2×）、3 ?L引物（2 μmol/L）、10 ?L DNA（1 ng/μL）模板和2 ?L ddH2O。反應程序：98 ℃ 1 min;98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s（30個循環）;72 ℃ 5 min（Bio-rad T100梯度PCR儀）。PCR產物經檢測合格后進行文庫構建，在Illumina Hiseq PE250測序平臺進行測序（諾禾致源生物信息科技有限公司）。

1.3.2? OTU聚類與物種注釋? 以97%的一致性將所有樣品的有效序列聚類成為OTU（Operational Taxonomic Units）。對OTU代表序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數據庫進行物種的注釋分析。

1.4? 數據處理

利用R軟件（V 2.15.3）繪制稀釋曲線圖。利用Qiime軟件（V 1.9.1）計算Sobs、Chao1豐富度指數和Shannon多樣性指數。用SPSS 22.0中的Student's t-test分析細菌群落豐富度和多樣性指數、物種相對豐度等在煙草連作田和輪作田土壤間的差異（p<0.05水平）。在屬水平上，采用LEfSe（LDA Effect Size）多級物種差異判別分析（LDA值=3）檢測連作田和輪作田土壤中具有顯著豐度差異的菌屬。

2? 結? 果

2.1? 數據質控

對煙草連作田和輪作田土壤細菌群落進行了數據質控與分析。結果表明（表1），4組樣品的有效序列數均在80 000條以上，平均序列長度在253～254 bp之間。在97%一致性的OTU分類水平下，獲得C_50、R_50、C_100和R_100的細菌OTU數量均在5000個以上，其中煙草移栽后50 d和100 d輪作田（R）土壤細菌群落OTU數量分別較煙草連作田（C）高1.26%和5.67%。

2.2? 土壤細菌群落多樣性和豐富度分析

煙草連作田和輪作田土壤細菌群落多樣性和豐富度指數見表2。結果表明，煙草移栽后50 d，輪作田（R_50）土壤細菌群落Sobs、Shannon和Chao 1指數分別較連作田（C_50）增加0.12%、0.41%和2.41%;煙草移栽后100 d，輪作田（R_100）土壤細菌群落Sobs、Shannon和Chao 1指數分別較連作田（C_100）增加5.41%、4.00%和13.02%，其中shannon（p=0.025）和Chao 1指數（p=0.049）在R_100和C_100間存在顯著差異。以上結果表明，萬壽菊-煙草輪作可提高土壤細菌群落的多樣性和豐富度。

2.3? 土壤細菌門水平的組成及差異分析

對相對豐度高于1%的土壤細菌門進行了分析（表3）。結果表明，煙草連作田和輪作田煙草移栽后50 d時根際土壤高于1%的細菌門的相對豐度分別共占96.39%和95.20%;煙草移栽后100 d時分別共占96.82%和95.32%。變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和浮霉菌門（Planctomycetes）的相對豐度在C_50、R_50、C_100和R_100中均高于1%;此外，奇古菌門（Thaumarchaeota）在C_50和C_100中的相對豐度也高于1%。Students t-test差異分析結果表明，煙草移栽后50 d時，輪作田（R_50）土壤中酸桿菌門和擬桿菌門的相對豐度顯著高于連作田（C_50）;煙草移栽后100 d時，輪作田（R_100）土壤中奇古菌門的相對豐度顯著低于連作田（C_100）。

2.4? 土壤細菌屬水平的組成及差異分析

2.4.1? 土壤細菌屬水平的組成? 對相對豐度高于1%的土壤細菌屬進行了分析（圖1）。結果表明，煙草移栽后50 d時，煙草連作田（C_50）和輪作田（R_50）土壤中鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、Pseudarthrobacter、乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、H16、RB41和Bryobacter的相對豐度均高于1%;此外，unidentified_Gemmatimonadaceae和水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）的相對豐度在C_50中高于1%，但在R_50中低于1%;馬賽菌屬（Massilia）的相對豐度在R_50中高于1%，但在C_50中低于1%。煙草移栽后100 d時，煙草連作田（C_100）和輪作田（R_100）土壤中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、Pseudarthrobacter、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、H16、馬賽菌屬（Massilia）和Ramlibacter的相對豐度均高于1%;此外，慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）的相對豐度在R_100中高于1%，但在C_100中低于1%。

2.4.2? 細菌屬水平上的LEfSe多級物種差異判別分析? 在細菌屬水平上，對煙草連作田和輪作田土壤細菌群落進行了LEfSe物種差異判別分析（圖2）。結果表明，煙草移栽后50 d時，煙草連作田（C_50）和輪作田（R_50）根際土壤共有8個細菌屬存在顯著性差異，其中C_50中水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）、魏斯氏菌屬（Weissella）、unidentified_Gemmatimonadaceae和鏈球菌屬（Streptococcus）;R_50中假單胞菌（Pseudomonas）、Candidatus_Solibacter、馬賽菌屬（Massilia）和RB41是煙草連作田和輪作田土壤細菌群落差異的主要類群。煙草移栽后100 d時，煙草連作田（C_100）和輪作田（R_100）根際土壤共有9個細菌屬存在顯著性差異，其中C_100中Rhodanobacter和Gaiella;R_100中慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）、新鞘氨醇桿菌（Novosphingobium）、Bryobacter、水庫桿菌屬（Piscinibacter）、黃色土源菌（Flavisolibacter）、Ramlibacter和馬賽菌屬（Massilia）是煙草連作田和輪作田土壤細菌群落差異的主要類群。

3? 討? 論

土壤微生態是有效評價土壤健康狀況的重要指標[11]。在引起烤煙連作障礙的諸多因素中，根際微生態失調是主要因素[12]。因此，調理根際土壤微生態是解決煙草連作障礙的關鍵。

研究表明，微生物群落多樣性可反映其響應脅迫的能力，群落多樣性和豐富度指數越高，其響應脅迫的修復能力也越強[13]。在細菌、真菌等微生物群落中，細菌群落多樣性通常被認為是恢復生態功能進而維持生態系統平衡的重要指標[14]。本研究中，萬壽菊-煙草輪作可明顯提高煙株根際土壤細菌群落Sobs、Shannon和Chao 1等多樣性和豐富度指數。因此，萬壽菊-煙草輪作可提高土壤細菌群落響應脅迫的修復能力，有助于恢復微生態平衡。

研究表明，當種植模式等外界環境發生變化時，土壤微生物迅速響應，導致微生物豐度、組成等發生動態變化[15]。本研究也得到類似結論，萬壽菊-煙草輪作田土壤中酸桿菌門和擬桿菌門的相對豐度顯著升高。酸桿菌主要參與鐵循環和單碳化合物代謝，對植物殘體降解具有重要作用[16];而擬桿菌門的相對豐度在施用炭化稻殼復合土壤調理劑的土壤中也顯著升高[17]。因此，萬壽菊-煙草輪作有利于植物殘體降解，保持土壤生產力的穩定，其作用可能與施用炭化稻殼相當。

一些重要的細菌屬在植物生長、物質轉化、降解有害物質等方面具有重要作用。Pseudomonas是已明確的生防菌，具有促進植物生長、改善植物養分吸收狀況的作用，同時可有效防治多種作物土傳病害[18];Pseudomonas數量減少可能是導致連作土壤微生物群落發生變化的原因[19]。Candidatus_Solibacter、Bryobacter和Bradyrhizobium是與土壤中物質轉化有關的功能菌，分別具有分解有機質、促進土壤碳循環和固氮的作用，在番茄等作物有機種植和輪作田塊的土壤中這3種菌屬的相對豐度顯著升高[20-22]。Massilia、Novosphingobium和Ramlibacter可降解多環芳烴[23-25]，其中，Massilia通過產生對土壤病原真菌以及線蟲具有顯著防治作用的二甲基二硫醚，對土壤具有熏蒸作用[26]。Flavisolibacter為根際促生菌，可促進根系發育[27]。煙草-萬壽菊輪作后，煙株根際土壤中這些菌屬的相對豐度顯著升高，有利于改善土壤微生態環境，促進煙株生長發育，緩解連作障礙。

4? ?結? 論

本研究分析了萬壽菊-煙草輪作在調理植煙土壤細菌群落結構中的作用，為萬壽菊綜合利用提供了思路。萬壽菊-煙草輪作可提高煙株根際土壤細菌群落多樣性和豐富度，提升土壤響應脅迫的修復能力。在萬壽菊-煙草輪作土壤中，酸桿菌門和擬桿菌門的相對豐度升高，生防菌（Pseudomonas）、功能菌（Candidatus_Solibacter、Bryobacter和Bradyrhizobium）、降解菌（Massilia、Novosphingobium和Ramlibacter）和根際促生菌（Flavisolibacter）等菌屬的比例上升。因此，萬壽菊-煙草輪作對改善土壤微生態環境、緩解連作障礙具有積極作用。

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