蘋果細菌性枯枝病菌的生物學特性及抑菌藥劑篩選

李 燕，李洪濤，葉良超，周俊祥，羅 明,2

（1新疆農業大學農學院，烏魯木齊830052；2新疆維吾爾自治區高校農林有害生物監測與安全防控重點實驗室，烏魯木齊830052）

0 引言

蘋果是國內落葉果樹的第一大樹種，栽培面積、總產量、人均消費量及出口量均居世界之首，在果品產業中占有重要的地位[1-2]。近年來，隨著蘋果生產的面積和產量穩步增長，種植區域布局、品種結構和栽培模式發生了巨大變化，病害發生的種類和趨勢也隨之改變，愈加突出的病害問題成為制約果品質量安全和影響產業健康發展的重要因素。王金政[3]和胡清玉等[4]對國內主要蘋果產區的病害發生情況進行調查，共發現真菌、細菌、病毒（類病毒）和線蟲病害共50余種；明確了腐爛病(Valsa mali)、輪紋病(Botryospuaeria dothidea)、褐斑病(Diplocarpon mali)和斑點落葉病(Alternaria alternaria)是目前常見的且能形成嚴重危害的4種病害，和蘋果銹病等8種中度危害病害。近期陸續出現了炭疽葉枯病(Glomerella cingulata)、絲核菌葉斑病(Rhizoctonia solani)、枝 枯 病 (Lasiodiplodia pseudotheobromae)和套袋果實黑點病等新病害[5-7]。蘋果細菌性病害報道較少，主要有蘋果根癌病(Agrobacteriumtumefaciens)和蘋果毛根病(Agrobacterium rhizogene)2種根部病害，和蘋果皰斑病(Pseudomonas syringae pv.papulans)1 種果實病害[3,8]。當前蘋果生產中病害防控采取的措施包括栽植健康苗木、增強樹體營養、培育抗病品種、果實套袋、清除病殘體、化學防治和生物防治等，化學防治依然是病害防控的主要手段。因此，確定病害的病原，掌握其侵染和流行規律，篩選出高效低毒的防治藥劑，對于病害安全防控、提高果品質量和果園生態環境保護具有重要意義。

新疆伊犁具有得天獨厚的自然地理環境，是全國蘋果生產適宜區之一，也是新疆蘋果的主產區。近期筆者所在課題組在新疆伊犁地區新源縣的蘋果種植園內發現一種細菌性病害，導致蘋果嫩梢、枝條變為黑褐色并壞死，葉片干枯，其危害癥狀疑似為梨火疫病。經對發病枝條的顯微鏡檢查，發現有明顯的噴菌現象，確證為細菌病害。采用組織分離法分離病原菌，柯赫氏法則驗證其致病性，通過形態學、生理生化特性和分子生物學鑒定將病原菌確定為丁香假單胞菌丁香致病變種(Pseudomonas syringae pv.syringae)[9]。目前已報道由P.syringae pv.syringae引起的林木病害主要有冰核細菌杏花霜凍害[10]、梨果實細菌黑斑病[11]、梨花枯和芽枯病[12]、獼猴桃細菌性潰瘍病[13]、甜櫻桃流膠病[14]等，而侵染蘋果引起枯枝病尚未見報道。本研究在確定病原的基礎上，進一步測定、明確病原菌的生物學特性，篩選防病藥劑，旨在為了解病原菌的病原學特征，掌握該病害的發病規律和制定安全、高效的病害防治措施提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病原菌菌株及接種液 丁香假單胞菌丁香致病變種XY-5-1菌株由本實驗室從新疆伊犁新源縣蘋果園（品種為‘寒富’）采集的病枝條樣品中分離獲得、鑒定并保存，致病力測定為強致病力菌株。

1.1.2 供試培養基肉汁蛋白胨培養基(BPA)、蔗糖蛋白胨培養基(SPA)、金氏B培養基(KBA)、營養瓊脂培養基(NA)、酵母甘露醇培養基(YEM)、Luria-Bertani培養基(LB)參考文獻[15]的配方制備，營養瓊脂+5%蔗糖培養基（NA+5%蔗糖）在NA培養基基礎上添加蔗糖50.0 g。

1.1.3 供試藥劑 選用13種細菌殺菌劑作為供試藥劑，包括3%噻霉酮ME（江蘇輝豐農化股份有限公司）、80%波爾多液WP（珠海經濟特區瑞農植保技術有限公司）、10%丙硫唑SC（貴州通元生物技術有限公司）、72%農用鏈霉素SP（重慶豐化科技有限公司）、30%王銅SC（廣東大豐植保科技有限公司）、20%噻菌酮SC（浙江龍灣化工有限公司）、2%春雷霉素AS（江門市植保有限公司）、16%苯甲中生WP（深圳譜普信農化股份有限公司）、2%春雷霉素WP（海利爾藥業集團股份有限公司）、70%堿式碳酸銅WG（美國化農有限公司）、3%中生菌素WP（東莞市瑞德豐生物科技有限公司）、8%噻霉酮·春雷DP（陜西西大華特科技實業有限公司）、0.3%梧寧霉素AS（遼寧微科生物工程股份有限公司）。

1.2 病原菌生物學特性測定

1.2.1 病原菌接種液制備 將P.syringae pv.syringae XY-5-1菌株接種在NA+5%蔗糖培養基上，置于28.5℃恒溫暗培養48 h活化，挑取單菌落接種于NA+5%蔗糖培養液中，在28.5℃、160 r/min震蕩培養12 h，用分光光度計（UV-2000型、上海精密儀器儀表有限公司）測定OD600值為1.0～1.2左右的菌懸液作為接種液。

1.2.2 培養基對病原菌生長影響的測定 將1.2.1中的病原菌接種液按裝液量的1%接種量接種于各供試液體培養基中，每個300 mL三角瓶中裝入50 mL培養液，在180 r/min、28℃條件下搖床震蕩培養48 h，測定培養液OD600值作為菌體生長量指標，以同樣培養液接菌但未經培養的菌液作為對照。每個處理5次重復。

1.2.3 碳源和氮源對病原菌生長影響的測定 以蔗糖蛋白胨(SPA)為基礎培養基，分別將其中的蔗糖用等質量碳的果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉和山梨醇作替換，其中的蛋白胨分別以等質量氮的氯化銨、牛肉膏、酵母膏、?蛋白胨、甘氨酸、組氨酸、蘇氨酸、硫氨酸、丙氨酸、精氨酸作替換配制好培養液。按照1.2.2的方法接種病原菌、培養和測定培養液OD600值，各處理5次重復。

1.2.4 生長溫度、酸堿耐受性和耐鹽性測定

（1）溫度測定。將培養溫度分別設置為6、10、15、20、25、26、27、28、30、35、40、45℃，共12個梯度。

（2）酸堿耐受性。用1 mol/L HCl和1 mol/LNaOH調節NA+5%液體培養基初始pH分別為pH 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0、12.0，共13個梯度。

（3）耐鹽性。在NA+5%液體培養基中加入NaCl，將其終濃度分別調整為0%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%，共10個梯度。

各梯度處理均為5次重復，按照1.2.2的方法接種病原菌，180 r/min、28℃條件下（溫度試驗除外），搖床震蕩培養48 h后測定培養液OD600值。

1.2.5 致死溫度測定 取1 mL病原菌菌懸液（OD600為0.8～1.0）加入離心管中，分別放置在溫度為45、50、55、60、65℃的恒溫水浴鍋中，處理10 min（預熱1 min）后立即取出。取100 μL處理后的菌液在NA+5%蔗糖培養基平板上均勻涂布，28℃培養5天，檢查是否有菌落生長情況，每個處理5次重復。測定發現45℃處理有菌落長出，50℃以上未長菌落，推測致死溫度在45～50℃之間。通過金屬浴精確設定46、47、48、49℃溫度處理菌懸液，進一步確定加熱處理后菌懸液涂布平板，培養后無菌落生長的溫度為致死溫度。

1.2.6 紫外線對病原菌生長影響的測定 將100 μL病原菌菌懸液（活菌濃度約9×109CFU/mL）均勻涂布在NA+5%蔗糖培養基平板上，將涂菌平板放置在超凈工作臺紫外線燈管下（30 W，垂直距離20 cm）分別照射0 s、15 s、30 s、45 s、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min，在28℃培養箱中避光培養48 h，觀察、統計活菌量數。

1.3 化學藥劑的室內抑菌效果測定

將供試藥劑按照說明書中的推薦濃度制備成不同濃度的稀釋液。分別吸取各供試藥劑不同稀釋度2 mL稀釋液和病原菌菌懸液1 mL（活菌濃度1×105CFU/mL）加入到無菌培養皿中，再加入45℃的NA培養基10 mL充分混合均勻，冷卻凝固為混菌平板。每個濃度3次重復，對照采用無菌水代替藥劑。28℃培養箱中培養48 h，觀察、統計各處理平板上的細菌菌落數，計算抑菌率[式(1)]。以X為藥劑濃度對數值，Y為抑菌率求毒力回歸方程，計算半數效應濃度(EC50)[16]。

1.4 防病效果生物測定

采用離體枝條法，參照1.3結果選擇供試藥劑的最佳抑菌濃度做防效測定。采集健康蘋果（品種為‘黃太平’）當年生的幼嫩枝條。將枝條修剪為30 cm左右的莖段，用75%酒精浸泡30 s，再用無菌水沖洗3～4次。將處理后枝條插入（1/3長度）裝有0.1% NaCl溶液的三角瓶中[17]。按照平板抑菌試驗篩選出的抑菌效果較好的藥劑及濃度配制稀釋液，在蘋果枝條上均勻噴霧。24 h后在距離枝條頂端5 cm左右的葉腋處用滅菌手術刀切開一個約5 mm的傷口，將滅菌脫脂棉片（約2 cm2）蘸取2 mL菌液貼在傷口部位，再用保鮮膜包裹保濕。每個處理接種10個枝條，3次重復，以無菌水接種作為陰性對照。接種后的枝條放置在28℃、相對濕度為75%和12 h光照的人工氣候箱中。48 h后去掉脫脂棉，接種后第3天開始觀察病斑出現的初始時間，7天后記錄發病枝條數，測定枝條的病斑長度，統計發病率[式(2)]、病情指數[式(3)]和防治效果[式(4)]。

參考Paprstein等[18]方法并修訂，制定蘋果細菌性枯枝病接種離體枝條的病情分級標準[19]。0級—無病斑枝條，葉正常；Ⅰ級—枝條病斑長度占接種枝條長度的1%～5%；Ⅲ級—枝條病斑長度占接種枝條長度的6%～15%；Ⅴ級—枝條病斑長度占接種枝條長度的16%～30%；Ⅶ級—枝條病斑長度占接種枝條長度的31%～50%；Ⅸ—枝條病斑長度占接種枝條長度＞51%。

1.5 數據分析

根據SPSS Statistics 19.0軟件進行數據處理分析，并運用Duncan檢驗進行統計學多重比較。

2 結果與分析

2.1 蘋果細菌性枯枝病病原菌的生物學特性

2.1.1 不同培養基對病原菌生長的影響 圖1顯示，病原菌在BPA、SPA、KBA、NA、YEM、NA+5%蔗糖、LB培養基中均能生長，但在不同的培養基中生長速度不同，生長量具有顯著差異。在NA+5%蔗糖培養基中病原菌生長速度最快、生長量最大，顯著優于其他培養基(P＜0.05)，為病原菌最適生長培養基；其次是BPA、SPA、LB、NA和KBA培養基，而在YEM培養基中的生長最差。

圖1 不同培養基對病原菌生長的影響

2.1.2 不同碳源、氮源對病原菌生長的影響 表1結果顯示，P.syringaepv.syringaeXY-5-1菌株在9種供試碳源培養基上的生長量不同，蔗糖＞甘露醇＞山梨醇＞葡萄糖＞果糖＞麥芽糖＞乳糖＞半乳糖＞淀粉。以蔗糖為碳源的培養基中菌體生長量最高(OD600=1.91)，為最適碳源；甘露醇和山梨醇是較適碳源，其次是葡萄糖、果糖、麥芽糖，在這3種碳源培養基中生長無明顯差異，對淀粉的利用率相對較差。

表1 碳源和氮源對P.syringae pv.syringae菌株生長的影響

P.syringaepv.syringaeXY-5-1菌株在11種供試氮源培養基上的生長量由大到小為牛肉膏＞蛋白胨＞?蛋白胨＞組氨酸＞酵母膏＞丙氨酸＞精氨酸＞氯化銨＞硫酸銨＞甘氨酸＞蘇氨酸。其中牛肉膏為最適氮源，菌體生長量最高(OD600=1.95)，在以蛋白胨、?蛋白胨、組氨酸、酵母膏、丙氨酸為氮源的培養基中菌體生長較好，在硫酸銨、甘氨酸和蘇氨酸為氮源的培養基中菌體生長量相對較低。

2.1.3 溫度對病原菌生長的影響 由圖2可見，P.syringaepv.syringaeXY-5-1菌株在6～40℃均能生長。當溫度為25～30℃時，病原菌生長較好，27℃作為該病原菌的最適生長溫度。在溫度為15℃以下和34℃以上時，病原菌的生長受到明顯的限制；當40℃時，病原菌基本不再生長。進一步通過金屬浴精確測定，該菌株在49℃中處理10 min后，平板培養結果為5天后沒有菌落再生長，故確定其致死溫度為49℃。

圖2 不同溫度對病原菌生長的影響

2.1.4 酸堿度對病原菌生長的影響P.syringaepv.syringaeXY-5-1菌株在pH 5.0～10.0的范圍內均能生長，但在不同的pH條件下生長速度不同（圖3）。病原菌適宜生長環境為pH 7.0～9.0，最適生長為pH 7.5。當pH＜4.0和pH＞11.0時，病原菌的生長停滯。

圖3 不同pH對病原菌生長的影響

2.1.5 NaCl濃度對病原菌生長的影響 圖4結果顯示，當NaCl濃度低于8%時，P.syringaepv.syringaeXY-5-1菌株均可以生長，0.5%NaCl最適合病原菌的生長，當NaCl的濃度超過1%時病原菌的生長開始受到抑制，NaCl的濃度達到8%時病原菌的生長完全停滯。

圖4 不同NaCl濃度對病原菌的影響

2.1.6 紫外線對病原菌的影響 圖5結果表明，活菌濃度為9×109CFU/mL病原菌菌懸液在紫外線燈下(30 W，20 cm)照射15 s時，活菌濃度降至1.37×103CFU/mL，存活率顯著降低；隨著紫外線照射時間延長，病原菌活菌明顯下降，當照射時間超過6 min，病原菌徹底死亡，殺菌率為100%。

圖5 紫外線照射對病原菌的影響

2.2 藥劑抑菌效果測定

2.2.1 藥劑平板抑菌效果 13種供試藥劑對P.syringaepv.syringaeXY-5-1菌株在所測定的濃度范圍內均有一定的抑菌效果，不同藥劑、同一藥劑不同濃度之間的抑制效果有明顯差異。通過比較各藥劑的不同濃度的抑菌率，建立了供試藥劑的毒力回歸方程，并計算出半數效應濃度EC50值（表2）。抑菌率及EC50值表明，供試藥劑抑菌效果由大到小表現為3%噻霉酮ME＞0.3%梧寧霉素AS＞3%中生菌素WP＞2%春雷霉素WP＞30%王銅SC＞8%噻霉酮·春雷DP＞2%春雷霉素AS＞20%噻菌銅SC＞10%丙硫唑SC＞72%農用鏈霉素SP＞16%苯甲中生WP＞70%堿式碳酸銅WG＞80%波爾多液WP。其中3%噻霉酮ME的EC50為6.43 mg/L，在較低用藥量下即可取得90%以上的抑菌率，抑菌效果最佳。其次是EC50在10～40 mg/L之間的藥劑，有0.3%梧寧霉素AS、3%中生菌素WP、2%春雷霉素WP和30%王銅SC抑菌效果較好。再次是EC50在40～60 mg/L的藥劑，有8%噻霉酮·春雷DP、2%春雷霉素AS、20%噻菌銅SC和10%丙硫唑SC。16%苯甲中生WP、70%堿式碳酸銅WG和80%波爾多液WP的EC50＞70 mg/L，抑菌效果不佳。

2.2.2 離體枝條法測定供試藥劑防效結果 對經過室內抑菌測定的供試藥劑進行離體枝條法試驗，驗證其防病效果。表3結果顯示，在保護性施藥條件下，7天后各供試藥劑的防效可達到31.29%～82.66%。防效由大到小依次為3%噻霉酮ME＞2%春雷霉素AS＞20%噻菌銅SC＞10%丙硫唑SC＞72%農用鏈霉素SP＞80%波爾多液WP＞2%春雷霉素WP＞70%堿式碳酸銅WG＞16%苯甲中生WP＞30%王銅SC。其中3%噻霉酮ME的防效最好，平均防效可達82.66%。次者是2%春雷霉素AS和20%噻菌酮SC，平均防效分別可達77.14%和73.09%；再次是10%丙硫唑SC、72%農用鏈霉素SP、80%波爾多液WP，平均防效都在50%以上；16%苯甲中生WP與30%王銅SC的防效相對較差，平均防效分別為34.52%和31.29%。

表3 供試藥劑保護性施藥對蘋果細菌性枯枝病的防治效果

3 結論與討論

丁香假單胞菌(P.syringae)引發的植物病害位居十大植物細菌病害之首[20]，有60多個致病變種，丁香假單胞菌丁香致病變種(P.syringaepv.syringae)是其中一個致病變種[21]。本研究表明，造成蘋果細菌性枯枝病的病原菌P.syringaepv.syringae新疆分離物的最適生長培養基為NA+5%蔗糖培養基，能利用多種碳、氮源，對蔗糖和牛肉膏利用率最高。在溫度為6～40℃的范圍內，該病原菌可進行生長，27℃為最適生長溫度；最適pH 7.5；在0.5%NaCl鹽濃度下，病原菌生長良好，大于1%NaCl鹽濃度時生長受到抑制；49℃下10 min，紫外線照射6 min能使病原菌致死。管晶晶等[22]對造成新疆加工型辣椒細菌性葉斑病的病原菌P.syringae pv.syringae的測定結果顯示，最適生長溫度為28℃，pH 6.5～8.0范圍內，NaCl濃度為1%下生長較好，NaCl濃度大于4%時病原菌基本不再生長。而侵染丁香的P.syringae pv.syringae適合在24～27℃下生長，當氣溫高于30℃時，病斑的擴展被抑制[23]。本研究分離的蘋果細菌性枯枝病菌P.syringae pv.syringae的生物學特性與這些報道略有不同。P.syringae pv.syringae具有寄主廣泛和生態分布多樣性的特點，不同地區、不同寄主來源菌株的生物學特性上可能存在一定差異[24]。

目前植物細菌性病害防治的主要手段仍然是采用以銅制劑和抗生素為代表的殺菌劑進行化學防治。本研究針對蘋果細菌性枯枝病菌測定比較了13種藥劑的室內毒力，結果顯示均有一定的抑菌效果。抑菌率及EC50值顯示抑菌效果有強到弱為3%噻霉酮ME＞0.3%梧寧霉素AS＞3%中生菌素WP＞2%春雷霉素WP＞30%王銅SC＞8%噻霉酮·春雷DP＞2%春雷霉素AS＞20%噻菌銅SC＞10%丙硫唑SC＞72%農用鏈霉素SP＞16%苯甲中生WP＞70%堿式碳酸銅WG＞80%波爾多液WP。最低EC50為6.43 mg/L、抑菌效果最強的藥劑為3%噻霉酮ME，其次是0.3%梧寧霉素AS、3%中生菌素WP、2%春雷霉素WP和30%王銅SC。通過室內抑菌法初篩出的殺菌劑必須通過活體生物測定和田間試驗評價其防病效果。目前對果樹等木本植物病害殺菌劑的活體篩選主要采用田間果樹、苗圃或盆栽苗木、組培苗或植株離體組織等作為接種材料。采用苗木不僅鑒定材料數量有限，試驗周期長、占地多，而且樹木個體差異較大，接種植株發病不均一，病害分級較困難。國外在針對梨、蘋果等仁果類果樹重大檢疫性細菌病害梨火疫病(Erwinia amylovora)的防治藥劑篩選、品種抗病性評價中，采用對病原菌侵染反應靈敏的離體枝條、花器和幼果組織作為接種材料，具有簡便、快速及與活體植株篩選結果相關性較好等優點[25]。本研究借鑒梨火疫病的研究方法并結合本試驗，參考Paprstein等方法并修訂后制定了離體枝條接種病情分級標準，將病害分級準確量化。利用本研究建立的方法，先噴施藥劑再接種病原菌測定了供試藥劑的保護性防效。依據試驗結果，篩選出防效最好的藥劑為3%噻霉酮ME(82.66%)；2%春雷霉素AS和20%噻菌酮SC是其次，防效分別為77.14%和73.09%；再次是10%丙硫唑SC、72%農用鏈霉素SP、80%波爾多液WP，平均防效均在50%以上。試驗發現，室內平板抑菌效果較好的3%噻霉酮ME在離體枝條測定中同樣防效較好。但有的藥劑離體枝條防效和與平板抑菌試驗結果存在一定差異。如30%王銅SC和2%春雷霉素WP平板抑菌效果較好，但在生物測定中防治效果卻不理想；在平板抑菌試驗中抑菌效果一般的72%農用鏈霉素SP、2%春雷霉素AS、10%丙硫唑SC和20%噻菌酮SC卻在生物測定中防治效果較好。其原因可能是不同藥劑在培養基中的擴散性不同，會影響其測定結果；還有的藥劑具有揮發性，藥效發揮受環境因素的影響；有的藥劑具有內吸性，施藥后進入植株內可以內吸傳導，還具有激發植株自身抗病性的功能，因而導致藥效結果不一致。因此才能篩選出防治效果優良的藥劑，以投入實際運用，為防治病害提供有力的科學指導。

新疆伊犁是新疆重要的林果產區，被稱為“塞外江南”、“蘋果之鄉”。本研究針對從當地栽培的‘寒富’蘋果樹上發現的引起枯枝病的病原菌P.syringae pv.syringae，初步測定了影響病原菌生長的主要因子，未涉及影響病原菌在田間侵染寄主的環境因素；通過室內平板毒力測定篩選出抑菌化學藥劑，還需要進行活體植株及田間防效試驗進一步驗證其防病效果。該病原菌是否侵染其他蘋果栽培品種，病害的區域分布范圍和發生流行規律，及病害的關鍵防控技術措施等是后續工作需要重點研究的問題。