Fhb1基因改良‘周麥’品種赤霉病抗性研究

李楠楠，李順成，韓玉林，鄒少奎，杜曉宇，楊光宇，王麗娜，張 倩，呂永軍

（周口市農業科學院/河南省小麥種質改良工程技術研究中心/河南省作物分子育種與生物反應器重點實驗室，河南周口466001）

0 引言

小麥赤霉病(fusarium head blight，FHB)是廣泛發生在溫暖潮濕和半潮濕地區的一種毀滅性病害，由多種鐮刀菌引起[1-2]。中國是小麥赤霉病重發區，發生區域主要在長江中下游冬麥區和東北東部春麥區[3-4]。近年來隨著全球氣候變暖和小麥耕作制度的變化，病害逐漸向北蔓延至黃淮流域，黃淮麥區的赤霉病發生有越來越嚴重的趨勢。2001—2018年有9個年份小麥赤霉病的發生面積超過333萬hm2，2012年赤霉病發生更加嚴重，超過1000萬hm2，對小麥生產構成嚴重的威脅。目前，全世界尚缺乏高抗赤霉病或免疫的小麥品種，因此，進行小麥品種抗性改良，培育抗性品種是減輕小麥赤霉病危害的根本途徑。抗赤霉病的QTLs的不斷發掘將大大加快抗性基因向適應性良好的栽培品種的轉移。據報道，利用分子標記輔助選擇育種技術，已經在瑞士[5]、加拿大[6]、美國[7]、巴西[8]、日本[9]等選育出抗性顯著提高的小麥新品種。分子標記輔助選擇不僅解決表型鑒定不穩定的難題，還可提高選擇效率，縮短育種年限，具有很大的優越性[10-11]。國內外學者利用分子技術對小麥赤霉病抗性做了大量研究，已經鑒定和定位了分布在小麥21條染色體上250多個與抗赤霉病相關的QTLs[12-13]，目前公認的抗性最穩定和效應最大的抗性基因是Fhb1。Waldron等[14]首先報道‘蘇麥3號’3BS上的赤霉病抗性基因Fhb1。另外，在‘望水白’、‘黃方柱’、日本品種‘NyuBai’等多個抗源中也存在Fhb1基因[15]。Anderson等[16]研究認為Fhb1能解釋41.6%和24.8%的表型變異。Cuthbert等[17]研究Sumai3*5/Thatcher群體時，將Fhb1定位在XSTS3B-80～XSTS3B-142之間，遺傳距離為1.27 cM。賈海燕等[18]采用遺傳和BAC-物理作圖的方法，通過研究來源于‘望水白’的材料，將Fhb1基因精細定位在SSR標記Xwgrb597～Xmag9404之間，遺傳距離為0.19 cM。董晶晶等[19]利用‘黃方柱’和‘Wheaton’衍生的RIL群體對Fhb1進行精細定位，將其定位在分子標記X2214～X2357之間。2016年Rawat等[20]報道了Fhb1基因克隆的結果。Fhb1編碼一種帶有凝集素結構域以及類毒素成孔結構域的嵌合凝集素(pore-forming toxin-like，PFT)，通過突變體分析、基因過表達和沉默等試驗證實了PFT就是Fhb1編碼的基因。朱展望等[21]研究認為目前利用標記輔助選擇Fhb1的限制因素是缺乏低成本的診斷性標記，雖其連鎖標記在Xgwm493、Xgwm533、UMN10和Xsnp3BS-8等在育種中有一定應用[22-23]，但均受遺傳背景影響較大[24]。Rawat等證明Fhb1為PFT基因，對PFT鄰近基因His測序發現His位點的多態性，進而開發出Fhb1診斷性標記His-InDel，該標記擴增穩定、片段差異大、用瓊脂糖凝膠電泳即可檢測，成本較低，是理想的育種標記。本研究利用與抗赤霉病基因Fhb1緊密連鎖的診斷性標記His-InDel篩選‘周麥’改良抗性材料，配合田間單花滴注接種鑒定材料抗性，旨在通過分子檢測改良抗赤霉病小麥品系，加速‘周麥’的抗赤霉病育種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究利用本地主栽‘周麥’品種（系‘）周麥22號’、‘周麥32號’、‘周11550’等與綜合性狀良好的抗赤霉病小麥品種‘寧麥9號’‘、生選6號’‘、揚麥21’等配置一系列雜交組合，經選擇獲得F3株系113個、F4株系188個、F5株系178個、F6株系142個，總共621個株系。

田間接種鑒定中，將黃淮麥區的中感赤霉病品種‘淮麥20’作為對照材料，當單花滴注后‘淮麥20’發病達到3級以上，抗赤霉病鑒定視為有效[25]。

1.2 田間試驗設計

2011—2017年在周口市農業科學院試驗基地進行雜交和后代單株選擇。2017年秋播同時將F3～F6后代種植于抗赤霉病鑒定圃，每個株系種植2行，寬窄行(20 cm+40 cm)，行長3 m，穴播。

1.3 抗赤霉病鑒定方法

將河南省農科院宋玉立研究員提供的5個赤霉菌菌 株（14F3-8、10YY1-3、14LY9-2-4、14ZK1-4 和14AY1-2）和江蘇省農科院張旭研究員提供的3個赤霉菌菌株（HG-1、J15和F0609）分別制備為分生孢子混合液（5×105孢子/mL）。在2018年小麥開花初期（10%麥穗揚花），采用單花滴注的方法[26]，將孢子懸浮液20 μL注入第5個小穗內（方向為由上而下），并對接種穗進行剪芒標記，每份材料接種10穗。接種后套袋保濕72 h，隨后定期利用迷霧裝置（自走式平移噴灌機，艾瑞德Irritech農業機械有限公司，中國安徽）噴霧保證田間濕度利于病害的發生。

1.4 統計分析

接種后第21天調查所有接種材料的發病情況，根據病害癥狀描述（0級，接種小穗無可見發病癥狀；1級，僅接種小穗發病，或相鄰的個別小穗發病，但病斑不擴展到穗軸；2級，穗軸發病，發病小穗占總小穗的1/4以下；3級，穗軸發病，發病小穗占總小穗的1/4～1/2；4級，穗軸發病，發病小穗占總小穗的1/2以上），逐份統計10個接種穗的發病情況，并依據病害輕重確定每個接種穗的嚴重度分級。分別計算河南和江蘇菌株病害嚴重度的平均值，依據平均嚴重度標準（高抗R，0＜平均嚴重度＜2.0；中抗MR，2.0≤平均嚴重度＜3.0；中感MS，3.0≤平均嚴重度＜3.5）確定材料對赤霉病的抗性水平[25]。

1.5 DNA提取

在大田剪取各株系的新鮮嫩葉片1～2 g，裝入自封袋中并編號，放入-20℃冰箱備用。參照Saghai-Maroof等[27]報道的CTAB法提取葉片基因組DNA。

1.6 SSR分析

按照朱展望[21]開發引物His-InDel的PCR反應體系，總體積 20 μL，含 2× PCR Mix（0.1 U/μLTaq酶、500 μmol/L dNTPs、20 mmol/L Tri-HCl、10 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2）10 μL，DNA 模板(50 ng/μL)2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL，ddH2O 7 μL。擴增程序為：95℃預變性 3 min；94℃變性30 s，65℃退火30 s，68℃延伸2.5 min,，共33個循環；最后68℃延伸7 min，4℃保存。PCR反應在PCR儀（S1000，Bio-Rad，美國）上進行。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 數據分析

用DPS 9.5數據處理系統（中國）和Excel 2007軟件（美國）對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 供試材料的抗赤霉病鑒定

來源于河南省和江蘇省的赤霉菌菌株接種供試材料，每份材料分別接種10穗。抗病性鑒定結果（表1）顯示，對河南赤霉菌表現高抗的材料占總數的7.9%、中抗占27.2%，比對江蘇赤霉菌表現高抗和中抗的材料多4和7.2個百分點；對河南赤霉菌表現中感和高感的材料占總數的38.6%和26.3%，比對江蘇赤霉菌表現抗性的材料少6.9和4.3個百分點，表明供試材料對江蘇赤霉菌的抗性比河南赤霉菌弱。

表1 2018年供試材料田間接種抗性鑒定結果

圖1表明，抗病親本‘寧麥9號’、‘生選6號’、‘揚麥21號’田間鑒定為中抗以上水平，而感病親本‘周麥22號’、‘周麥32號’田間鑒定為高感，‘淮麥20號’是黃淮麥區的中感對照，田間鑒定為中感，說明人工接種鑒定的發病情況比較充分。

按世代和赤霉菌來源分別對后代材料進行赤霉病抗性對比分析。江蘇赤霉菌侵染鑒定結果顯示，鑒定為中感的材料在每個世代的比例都是最高的（F3為 50.4%，F4為 45.7%，F5為 42.7%，F6為 45.1%）。而河南赤霉菌田間侵染結果表明，F3植株表現最多的抗性級別為中感，有53個株系，占F3材料的46.9%；同時F4最多的是高感(42.0%)，F5最多的是中感(39.9%)，F6最多的是中抗(47.9%)，高世代的抗性較低世代穩定提高，表明每年通過田間鑒定選擇農藝性狀和抗性兼備的材料進入下一代能夠顯著提高材料的群體抗性，單花滴注接種鑒定能有效改良小麥的赤霉病抗性。

2.2 抗赤霉病基因分子標記檢測供試材料

利用在3BS上Fhb1基因的診斷性標記His-InDel對雜交親本‘周麥22’、‘周麥32’、‘周11550’和‘寧麥9號’、‘生選6號’、‘揚麥21號’進行分子檢測。結果表明，‘寧麥9號’、‘生選6號’、‘揚麥21號’擴增片段為1309 bp，含有Fhb1基因；‘周麥22號’、‘周麥32號’、‘周11550’等不含Fhb1基因的擴增片段在2000 bp左右，與‘寧麥9號’等含Fhb1的品種差異明顯（圖2）。同時，利用該標記對621個后代材料進行基因型分析，檢測出210個株系攜帶Fhb1基因，其中田間鑒定表現高抗的材料有48個、中抗的有119個、中感的有34個、高感的有9個，中抗以上材料占比79.5%；不攜帶Fhb1基因的株系有411個，只有1個株系表現高抗，中抗的50個，中感、高感的分別是206、154個，感病材料占比87.6%（表2）。圖1中GD1(+)、GD2(+)、GD3(+)為3個攜帶Fhb1基因的高代材料，田間鑒定為中抗—高抗；GD4(-)、GD5(-)、GD6(-)為3個不攜帶Fhb1基因的高代材料，田間鑒定為高感。這說明分子標記檢測與人工接種鑒定結果的趨勢一致，通過分子標記檢測Fhb1基因結合田間抗性鑒定選擇效率很高。

表2 2018年周麥后代材料中Fhb1的檢測結果

圖1 單花滴注鑒定雜交親本、攜帶和不攜帶Fhb1基因的后代材料的田間抗性表現

圖2 His-InDel標記對親本和部分后代的擴增結果

2.3 田間鑒定材料在攜帶Fhb1基因和不攜帶之間的差異性分析

用Fhb1的分子標記His-InDel在后代中共篩選出210份材料，沒有篩選出抗性條帶的材料有411份。把含有Fhb1基因和不含Fhb1基因的材料分為2組，田間調查每份材料的平均嚴重度。利用DPS軟件統計這2組之間田間鑒定的差異是否顯著。F＞F0.01，表明2組材料的抗性差異達極顯著水平，含有Fhb1基因的抗赤霉性明顯高于不含Fhb1基因的材料（表3～4），表明通過Fhb1基因連鎖的分子標記輔助選擇育種提高赤霉病抗性是有效的。

表3 含Fhb1與不含Fhb1材料之間平均嚴重度方差分析

表4 攜帶Fhb1與不攜帶Fhb1的材料之間抗赤霉性的差異顯著性（LSD法）

3 討論

3.1 不同來源赤霉菌的抗性接種鑒定

小麥赤霉病抗性田間接種鑒定與評價方法有很多種，抗侵染一般采用土表撒病麥粒和穗部噴孢子懸浮液進行接種鑒定，評價方法一般采用病情指數和平均嚴重度。而單花滴注接種被廣泛應用于抗擴展的鑒定，調查接種穗的平均嚴重度作為抗性分級的評價標準[25]。本研究所使用的病原菌孢子分別來源于江蘇省和河南省2類不同的生態區環境，在孢子濃度、接種套袋保濕、溫度濕度、土壤和評價標準均一致的條件下，調查不同地域環境的病原菌孢子之間的抗性差異，試驗結果誤差小，可信度較高。結果表明后代材料對來源于江蘇省的赤霉菌比來源于河南省的抗性弱，這可能與長江中下游地區長期受赤霉病菌危害，而河南省所在的黃淮麥區歷史上一直不是赤霉病的高發區域，而兩地的生態環境不同導致赤霉病菌種的致病力也不同。

本研究以本地主栽半冬性、感赤霉病‘周麥’品種（系）‘周麥22號’、‘周麥32號’、‘周11550’為母本，長江中下游抗赤霉病品種‘寧麥9號’、‘生選6號’、‘揚麥21號’為父本配置雜交組合，通過田間單花滴注接種鑒定獲得F3～F6代材料。結果顯示，這些材料比高感親本‘周麥22號’等赤霉病抗性有顯著提升。不過，黃淮麥區不是赤霉病表型鑒定的理想環境，穩定的表型鑒定環境一直是本地區小麥抗赤霉病育種的難題，所以完善赤霉病抗性鑒定技術，是篩選抗性品種的重要研究工作。

3.2 抗赤霉病分子標記輔助選擇及其應用前景

分子標記輔助選擇技術具有準確、快速、實用和不受外界環境影響等特點，比表型鑒定更有優勢。目前有許多利用這種技術實現抗病改良的報道。Fhb1已被證明是抗性最強且穩定的抗赤霉病基因，周淼平等[28]研究‘蘇麥3號’與感病材料重組自交系群體中，發現位于3B上的抗赤霉病Fhb1基因兩側的分子標記Xgwm533和Xgwm493。此后，許多學者在不同遺傳背景下研究利用這2個標記進行抗性選擇具有較高的效率[10-11,29]。Liu等[22]開發出共顯性標記UMN-10，與Fhb1基因連鎖更加緊密，比SSR標記選擇效率更高。本研究選擇朱展望等開發的診斷性標記His-InDel，利用該標記鑒定材料穩定準確，是理想的育種標記。結果表明，抗赤霉病親本‘寧麥9號’、‘生選6號’、‘揚麥21號’均含有Fhb1基因，而感病親本‘周麥22號’、‘周麥32號’均不含Fhb1基因，說明Fhb1基因能有效地鑒定小麥赤霉病的抗性。后代中不含Fhb1基因的411份材料中，也有51份中抗以上的材料，又表明除Fhb1基因外還可能攜帶其他抗赤霉病基因發揮作用。

為進一步利用Fhb1基因提高分子標記輔助選擇效率，采用標記單體型輔助選擇和標記組輔助選擇，能夠很好地彌補單一分子標記的不足。多個SSR位點可以明顯在抗感品種中形成不同的單體型。Yu等[30]研究認為在抗赤霉病QTL區域和抗病品種‘蘇麥3號’相同的SSR標記有利等位數目，會影響抗性的強弱，在3BS上的QTL位點，1個SSR和‘蘇麥3號’等位，沒有2～3個SSR和‘蘇麥3號’等位的抗性強。說明針對‘蘇麥3號’有利等位的SSR標記組或者組成的單體型全部有利等位位點的選擇要明顯優于針對單個SSR的選擇。Arruda等[31]利用GWAS分析，與Fhb1基因關聯的4個SNP位點中，同時存在4個SNP位點其赤霉病抗性明顯高于只有1個或者2個SNP位點，這為下一步的工作指明了研究方向。另外，最新研究表明，通過生物工程方法控制TaHRC序列來提高小麥對FHB的抗性是一條新途徑。Su等[32]認為TaHRC基因是Fhb1介導的FHB耐藥的關鍵決定因素，該基因編碼一個假定的富含組氨酸的鈣結合蛋白。證明了TaHRC編碼了一個具有FHB易感性的核蛋白，并且該基因起始密碼子的缺失導致了FHB的抗性，開發了TaHRCGSM分子標記用于診斷缺失突變。

小麥赤霉病抗性屬于典型的多基因控制的數量性狀[33]，主要有抗侵入、抗擴展、抗DON毒素積累等類型[34]。育種上要把多個抗赤霉病基因聚合在一起難度很大，‘周麥’系列抗赤霉病育種可以采取循序漸進的方法，通過分子標記輔助選擇，把主效Fhb1基因轉育到主栽品種（系）中，快速改良育成品種的赤霉病抗性水平，再進行多個抗赤霉病基因的聚合，達到進一步提高小麥赤霉病抗性的目的。可以預期的是，小麥大面積豐產性與抗赤霉病性結合的育種目標是可以實現的。‘周麥’是黃淮南片最重要的系列品種之一，提升‘周麥’品種整體的抗赤霉病水平對增加本地小麥的產量和品質、提高社會經濟效益具有十分重要的意義。