高效親水作用色譜-蒸發(fā)光散檢測(cè)應(yīng)用于甘油磷酸膽堿含量測(cè)定

婁良(中山百靈生物技術(shù)股份有限公司，廣東 中山 528437)

0 引言

甘油磷酸膽堿(glycerylphosphorylcholine，簡(jiǎn)稱GPC)是一種重要的藥物原料。GPC的分子式為C8H20NO6P，是有甘油分子和磷酸膽堿基團(tuán)脫去水分子構(gòu)成，是重要的神經(jīng)傳遞質(zhì)乙酰膽堿的生物合成前體。GPC能在小腸和通過(guò)靜脈注射吸收，并且能進(jìn)入脂蛋白的結(jié)構(gòu)中[1]，因此具有藥用價(jià)值。研究表明，GPC有保肝作用[2]，有改善老年人認(rèn)知能力和記憶力的作用[3]，還有多種健腦功效，因此GPC在食品、藥品、化妝品領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。

GPC含量檢測(cè)方法的研究有許多。早在1985年，Joseph J Billadello等[4]研究了用核磁共振磷譜對(duì)完整組織中GPC的含量進(jìn)行測(cè)定，該方法回收率較高，但靈敏度低，重現(xiàn)性差。程琳等[5]研究了液質(zhì)聯(lián)用法，該方法能快速測(cè)定GPC的含量，且靈敏度高，穩(wěn)定性好，但因檢測(cè)成本高導(dǎo)致該方法應(yīng)用范圍不廣。

本研究采用HPLC-HILIC-ELSD方法檢測(cè)GPC的含量，色譜柱為Venusil HILIC色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.05 mol/L乙酸銨水溶液-(以乙腈-甲醇=6∶4)=2∶8，流速1.0 mL/min，ELSD檢測(cè)器，漂移管溫度70 ℃。該方法分析速度快，15 min即可完成單個(gè)樣品分析；主要物質(zhì)GPC與其他雜質(zhì)的分離度良好；log峰面積與log進(jìn)樣量的線性關(guān)系良好，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)GPC進(jìn)行定量結(jié)果準(zhǔn)確；方法重現(xiàn)性好，該方法可用于GPC的定量檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：高效液相色譜儀器(島津CBM-20A)、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(島津ELSD-LTII)、分析天平(賽多利斯BT125D)、Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱。

試劑：蒸餾水、甘油磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)品(含量99.5%韓國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)品)、甘油磷酸膽堿供試品(中山百靈生物技術(shù)有限公司批號(hào)GP20630-GP20632)、乙腈(色譜純，阿拉丁)、乙醇(色譜純，阿拉丁)、乙酸銨(分析純，阿拉丁)。

1.2 色譜分析條件

高效液相系統(tǒng)：島津LC-20AT、等度洗脫、流速1.0 mL/min、色譜柱Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5μm)、柱溫40 ℃、進(jìn)樣量20μL、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、漂移管溫度70 ℃、增益2(×2)、過(guò)濾器10sec、流動(dòng)相為0.05 mol/L乙酸銨水溶液-(乙腈-甲醇=6∶4)=2∶8。

1.3 GPC含量測(cè)定

取甘油磷酸膽堿(GPC)對(duì)照品適量，精密稱定，用流動(dòng)相稀釋定容，配制成濃度為0.1 mg/mL和1 mg/mL的GPC對(duì)照溶液。

取甘油磷酸膽堿(GPC)供試品適量，精密稱定，用流動(dòng)相稀釋定容，配制成濃度為0.5 mg/mL的GPC供試品溶液。

精密量取GPC對(duì)照溶液及GPC供試品溶液各20 μL進(jìn)樣。

推薦理由:著名詞學(xué)大家葉嘉瑩曾說(shuō)，她遇到人生中所有的挫折和苦難，都用唐代詩(shī)人李商隱的詩(shī)來(lái)化解。這本書(shū)就是葉嘉瑩以己為例，講述李商隱對(duì)自己從幼童到耄耋八十余年的影響。其中既結(jié)合李商隱的遭遇講述李詩(shī)的深層內(nèi)涵和豐富的心靈境界，又展現(xiàn)了作者在人生不同階段的不同體悟，充分展示了中華優(yōu)秀古典詩(shī)詞對(duì)現(xiàn)代人心靈的指引作用。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分析條件確定

2.1.1 色譜柱及分離體系選擇

由于甘油磷酸膽堿(GPC)是水溶性且極性非常大的物質(zhì)，在普通RPLC-C18體系上保留時(shí)間非常短，而GPC樣品的水溶性無(wú)法選擇普通的正相體系。綜上所述，選擇親水作用色譜(HILIC)模式，通過(guò)對(duì)不同品牌以及不同填料的HILIC色譜柱進(jìn)行篩選，最后發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺鍵合硅膠填料的HILIC色譜柱對(duì)GPC及其雜質(zhì)有較好的分離效果以及重現(xiàn)性，最終選擇Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱。

2.1.2 流動(dòng)相選擇

根據(jù)親水色譜模式的流動(dòng)相選擇以及樣品性質(zhì)，分別篩選了甲醇-水、乙腈-水、緩沖鹽-甲醇-乙腈體系，根據(jù)樣品分離效果、保留時(shí)間以及響應(yīng)值，最終選擇0.05 mol/L乙酸銨水溶液-(乙腈-甲醇=6∶4)=2∶8作為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，柱溫40 ℃，下圖1為GPC的HPLC圖譜。GPC分離度大于2.0，GPC保留時(shí)間為6.662 min，可以在15 min以內(nèi)快速完成樣品的分析。

圖1 GPC的HPLC圖譜

2.1.3 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器參數(shù)的優(yōu)化

ELSD作為一種通用型質(zhì)量檢測(cè)器，待測(cè)物經(jīng)色譜分離后進(jìn)入霧化器，霧化為很小的顆粒，這些霧化顆粒進(jìn)入漂移管，揮發(fā)性流動(dòng)相氣化蒸發(fā)，剩余的微小顆粒通過(guò)光束時(shí)產(chǎn)生光散射效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了漂移管溫度、增益以及過(guò)濾器等參數(shù)并以氮?dú)鉃檩d氣，結(jié)果表明60～90 ℃時(shí)響應(yīng)值最高。漂移管溫度過(guò)高會(huì)縮短檢測(cè)器壽命，因此設(shè)置漂移管溫度為70 ℃，增益2(×2)，過(guò)濾器10sec。

2.2 檢測(cè)限和定量限

取甘油磷酸膽堿(GPC)適量，加流動(dòng)相定量稀釋后進(jìn)樣，記錄色譜圖。以信噪比約為3∶1的濃度作為檢測(cè)限，信噪比約為10∶1的濃度作為定量限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以信噪比約為3∶1時(shí)的濃度作為檢測(cè)限，甘油磷酸膽堿(GPC)的檢測(cè)限為0.005 9 mg/mL，相當(dāng)于樣品濃度的1.2%，以信噪比約為10∶1時(shí)的濃度作為定量限，甘油磷酸膽堿(GPC)的定量限為0.011 mg/mL，相當(dāng)于樣品濃度的2.2%。

2.3 線性范圍

2.3.1 線性溶液的配制

精密稱取100 mg甘油磷酸膽堿(GPC)標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，制成2 mg/mL的母液。分別精密移取0.5、0.75、1.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL母液于10 mL量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，得到濃度分別為0.1、0.15、0.3、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的GPC標(biāo)準(zhǔn)液。

2.3.2 線性回歸

取2.3.1中配制好的GPC系列標(biāo)準(zhǔn)液，分別進(jìn)樣20 μL，以保留時(shí)間定性，峰面積定量。以各GPC標(biāo)準(zhǔn)液的log峰面積為縱坐標(biāo)Y，以該溶液的log進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)X，進(jìn)行線性回歸，得到相應(yīng)線性回歸方程為y=1.374 9x+3.377 3(r=0.999 9)，說(shuō)明甘油磷酸膽堿(GPC)在0.1～1.4 mg/mL范圍內(nèi)線性良好。甘油磷酸膽堿(GPC)線性回歸圖見(jiàn)圖2。

圖2 甘油磷酸膽堿(GPC)線性回歸圖

2.4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取甘油磷酸膽堿(GPC)標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，用流動(dòng)相稀釋定容，配制成濃度為1.0 mg/mL的GPC標(biāo)液，每2 h進(jìn)樣1次分析，共測(cè)定6次，實(shí)驗(yàn)周期為12 h，結(jié)果表明計(jì)算GPC標(biāo)液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性好，峰面積計(jì)算RSD為0.65%。

2.5 精密度以及方法回收率

2.5.1 重現(xiàn)性

配制的濃度為0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL的GPC系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣20 μL，每個(gè)溶液連續(xù)進(jìn)三次。三個(gè)濃度下的9次連續(xù)進(jìn)樣的GPC響應(yīng)值Rf(log進(jìn)樣量/GPC log峰面積)RSD為0.58%，結(jié)果小于2.0%，說(shuō)明該方法的重現(xiàn)性好。

2.5.2 中間精密度

不同日期不同檢測(cè)人員重復(fù)重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，GPC響應(yīng)值(log進(jìn)樣量/GPC log峰面積)RSD為0.88%，結(jié)果小于2.0%，說(shuō)明該方法中間精密度好。

2.5.3 方法回收率

取已知甘油磷酸膽堿(GPC)含量的甘油磷酸膽堿(GPC)供試品6份，精密稱定，加入甘油磷酸膽堿(GPC)對(duì)照品0.5 mg/mL，用流動(dòng)相溶解混勻后按1.2項(xiàng)下的方法進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明6份樣品加入同一濃度回收溶液得到甘油磷酸膽堿(GPC)的回收率均在98%～101%之間，且RSD＜1.0%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.6 樣品分析

取三個(gè)批號(hào)(GP20630、GP20631、GP20632)的甘油磷酸膽堿(GPC)供試品按照本方法所述操作進(jìn)行甘油磷酸膽堿(GPC)供試品含量測(cè)定，GP20630、GP20631、GP20632三個(gè)批號(hào)的甘油磷酸膽堿(GPC)供試品含量測(cè)定結(jié)果分別為98.0%、98.3%、98.2%。

3 結(jié)語(yǔ)

文章選用親水作用色譜法配合ELSD檢測(cè)器，建立了利用高效液相色譜快速測(cè)定樣品中GPC含量的檢測(cè)方法。相對(duì)于其他主流分析方法，該方法適用范圍更廣且穩(wěn)定性好，可以適用于各種復(fù)雜樣品中GPC含量分析，操作簡(jiǎn)便、快捷，并且該方法還能有效地提高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性。