乳酸片球菌的抑菌能力及其對斷奶仔豬腸道菌群及黏膜免疫的影響

周登峰 劉雪連 劉 瀅 甘大維*

1.武漢大北農農牧發展有限公司，武漢430000；2.北京市飼料安全生物調控工程技術研究中心，北京100192

新生期和斷奶期是限制我國集約化、規模化養豬生產效率的2 個關鍵環節，改善新生和斷奶仔豬腸道健康，避免或減少腸道病原微生物感染是養豬生產中亟待解決的重大課題[1-2]。有報道[3-7]稱乳酸片球菌在抑制病原菌生長、改善腸道微生物群落結構、刺激宿主免疫等方面表現出良好的益生性能，但是相比較其他益生菌，該菌在斷奶仔豬上的應用報道較少。本試驗研究乳酸片球菌SKL-03 的體外抑菌能力及其對斷奶仔豬腸道微生物菌群和免疫能力的影響，以期為乳酸片球菌制劑在斷奶仔豬生產中的應用提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）菌株。試驗用乳酸片球菌SKL-03 分離于健康斷奶仔豬糞便；大腸桿菌k88、豬霍亂沙門氏菌ATCC13312、金黃色葡萄球菌ATCC6538 均由飼用微生物工程國家重點實驗室保存。乳酸片球菌SKL-03試驗品：發酵液和凍干粉（活菌數≥5×108cfu/g）；上清液：發酵液經10 000 r/min，3 min 離心后的上清液；由北京大北農科技集團股份有限公司飼用微生物工程國家重點實驗室制備。

2）試驗試劑。MRS 培養基（青島奧博星）、NB 培養基（青島奧博星）、脫脂乳粉、谷氨酸鈉、抗壞血酸、蔗糖、海藻糖（北京綠琪生物科技有限公司）、乳酸、乙酸標準品（sigma 公司）。

1.2 抑菌性能

1）試驗設計。發酵液組：乳酸片球菌SKL-03 發酵液（含活菌數5×108cfu/mL）；凍干粉組：乳酸片球菌SKL-03 凍干粉（含活菌數5×108cfu/mL）；上清液組：乳酸片球菌SKL-03 發酵液經10 000 r/min，3 min 離心后的上清液；培養基組：MRS 培養基；凍干保護劑組：凍干保護劑（脫脂乳粉15%、谷氨酸鈉1.5%、抗壞血酸1%、蔗糖2%、海藻糖7%）。

2）試驗方法。有機酸測定：HPLC 法；流動相：0.05%硫酸溶液；色譜柱：C18 柱；流速：1 mL/min，紫外檢測器，210 nm。樣品過0.45 μm 的濾膜后，上機檢測。

牛津杯法[8]：將已滅菌的LB 瓊脂培養基加熱到完全融化，倒在培養皿內，每皿15 mL（下層），待其凝固。此外，將融化的培養基冷卻到50 ℃左右混入致病菌（大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌）濃度約為1×108cfu/mL，將混有致病菌的培養基5 mL加到已凝固的培養基上待凝固（上層）。用無菌水將待檢樣品稀釋：乳酸片球菌SKL-03 發酵液稀釋成0.1 mL/mL、凍干粉0.1 g/mL、上清液0.1 mL/mL；在培養基表面垂直放上牛津杯，在杯中加入培養基空白及待檢樣品各150 μL，加滿后在37 ℃培養16~18 h；游標卡尺測量抑菌圈大小。

1.3 動物功效試驗

1）試驗動物與試驗設計。將90 頭體重、性別比例相近的21日齡杜長大斷奶仔豬隨機分為4 組，A組：飼喂基礎日糧；B 組：飼喂基礎日糧+乳酸片球菌SKL-03 菌粉1 kg/t；C 組：飼喂基礎日糧+乳酸片球菌SKL-03 上清液1 L/t；D 組：飼喂基礎日糧+乳酸片球菌SKL-03 發酵液1 L/t。每組6 個重復，每個重復3 頭豬，試驗期49 d。

2）試驗飼糧及飼養管理。試驗基礎日糧為玉米-豆粕型日糧，參照NCR（2012）7~11、11~25 kg 階段豬營養需要配制，基礎日糧組成及營養水平見表1。本試驗在武漢綠色巨農農牧股份有限公司進行，養殖及防疫程序按豬場規定進行。

表1 基礎飼糧組成及營養水平（風干基礎）

3）樣品采集與處理。于試驗第49 天結算飼糧，所有豬只禁食12 h。試驗第50 天對所有試驗豬進行稱重并記錄，按順序屠宰。采集十二指腸、空腸黏膜樣品和結腸、盲腸食糜樣品，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

4）腸道微生物群落。采用實時熒光定量法[9]測定得到斷奶仔豬結腸和盲腸中大腸桿菌、沙門氏菌和乳酸桿菌的數量。

5）免疫功能。十二指腸和空腸黏膜中SigA 的含量采用豬分泌型免疫球蛋白A（SigA）酶聯免疫吸附試驗試劑盒檢測。

1.4 數據分析

使用SPASS 20.0 統計軟件進行單因素方差分析，數據以“平均值±標準誤差”表示，P＜0.05 為差異顯著，0.05≤P＜0.10 為有顯著差異趨勢。

2 結果與分析

2.1 乳酸片球菌SKL-03 試驗品對致病菌的抑制作用

由表2可知，相比于培養基組和凍干保護劑組，不同試驗品對致病菌均有顯著抑制作用（P＜0.05），乳酸片球菌SKL-03 發酵液組抑菌效果最佳，上清液組次之，凍干粉組抑菌圈直徑最小；不同試驗品組抑菌圈直徑隨乳酸和乙酸含量的降低而下降。

表2 乳酸片球菌SKL-03 試驗品有機酸含量及對指示菌的抑制效果

2.2 乳酸片球菌SKL-03 對斷奶仔豬腸道菌群的影響

由表3可知，與空白組相比，菌粉組、上清液組、發酵液組盲腸中的大腸桿菌和沙門氏菌的數量顯著降低（P＜0.05）、乳桿菌數量顯著提高（P＜0.05）；菌粉組、上清液組結腸中大腸桿菌數量顯著降低（P＜0.05），發酵組差異不顯著（P＞0.05）；各組間結腸中乳酸桿菌數量差異不顯著（P＞0.05）；菌粉組和發酵液組結腸中沙門氏菌數量顯著降低（P＜0.05），上清液無顯著差異（P＞0.05）。

表3 乳酸片球菌制劑對70日齡仔豬盲腸和結腸菌群的影響

2.3 乳酸片球菌SKL-03 對斷奶仔豬十二指腸和空腸SIgA 的影響

由表4可知，與空白組相比，上清液組、發酵液組十二指腸黏膜中SIgA 含量顯著提高（P＜0.05），菌粉組差異不顯著（P＞0.05）；菌粉組、上清液組、發酵液組空腸黏膜中SIgA 含量顯著提高（P＜0.05），菌粉組對空腸黏膜中SIgA 含量影響最大，顯著高于上清液組和發酵液組（P＜0.05）。

表4 乳酸片球菌制劑70日齡仔豬十二指腸和空腸黏膜中SIgA 含量的影響

3 討 論

3.1 乳酸片球菌SKL-03 對致病菌的抑制作用

研究[10-12]表明，乳酸片球菌產生的有機酸和乳酸片球菌素等能有效抑制致病菌。本試驗研究表明，乳酸片球菌SKL-03 菌粉、上清液、發酵液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌均有顯著的抑菌效果，這與王建設等[13]、Mduduzi[14]、陳亞男等[15]的研究結果相似；在牛津杯法抑菌試驗中，發酵液組的抑菌效果最好，其次是上清液組；且抑菌能力與試驗品中的有機酸含量有關，試驗品種有機酸含量越高，抑菌圈直徑越大，表明乳酸片球菌可通過產生有機酸等抑菌物質抑制病原菌的生長。

3.2 乳酸片球菌SKL-03 對斷奶仔豬腸道菌群的影響

斷奶應激因降低仔豬腸道有益菌數量，增加有害菌數量而危害斷奶仔豬的健康[16]。諸多研究[17-20]表明，在斷奶仔豬飼糧中添加乳酸菌具有調節腸道微生物群、保持仔豬腸道微生物群穩定的效果。本試驗研究表明，與空白組相比，菌粉組、上清液組、發酵液組盲腸中的大腸桿菌和沙門氏菌的數量顯著降低（P＜0.05）、乳桿菌數量顯著提高（P＜0.05）；菌粉組、上清液組結腸中大腸桿菌數量顯著降低（P＜0.05），菌粉組和發酵液組結腸中沙門氏菌數量顯著降低（P＜0.05），乳酸桿菌數量差異不顯著（P＞0.05），這與學者們[21-24]的研究結果相似；這表明飼糧中添加乳酸片球菌及其代謝產物能夠抑制有害菌生長，改善腸道微生態環境。

3.3 乳酸片球菌SKL-03 對斷奶仔豬十二指腸和空腸SIgA 的影響

SIgA 具有對機體實現免疫保護的作用[16]，本試驗結果表明，飼料中添加乳酸片球菌SKL-03 及其代謝產物可通過提高十二指腸及空腸黏膜中SIgA的含量來對機體實現免疫保護。

4 結 論

本試驗條件下，乳酸片球菌SKL-03 菌粉、上清液、發酵液具有抑制病原菌生長的作用，在飼糧中添加上述試驗品具有降低腸道致病菌的數量，提高有益菌數量和小腸黏膜免疫功能的效果。