鴨坦布蘇病毒凍干高免卵黃抗體的研制

王紅琳 盧 琴 羅青平 張蓉蓉 溫國元 商 雨 邵華斌

湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所/農業農村部畜禽細菌病防治制劑創制重點實驗室，武漢430064

鴨坦布蘇病毒病是由黃病毒科、黃病毒屬的坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）引起的以產蛋鴨產蛋量驟降和雛鴨或育成鴨出現神經癥狀為主要特征的一種新型急性傳染病，又稱為鴨出血性卵巢炎、鴨黃病毒病。以種鴨、蛋鴨產蛋量急劇下降，產蛋率從產蛋高峰90%左右下降至10%不等；雛鴨發生神經系統癥狀甚至死亡為主要特征[1-2]。自2010年暴發以來，該病在我國大陸地區廣泛傳播，給國內的家禽養殖業造成了嚴重的經濟損失。該病傳播迅速，蔓延范圍廣，給養鴨業造成了嚴重的經濟損失[3-4]。卵黃抗體（IgY）是預防和緊急治療該病的有效防制劑[5]，由于常規卵黃抗體一般為液體，質量不穩定、副作用大、體積大運輸不便。因此，本試驗通過用鴨坦布蘇病毒滅活疫苗免疫SPF 蛋雞后，收集卵黃進行IgY的提純和凍干研究，旨在克服常規卵黃抗體的缺陷，達到有效預防和治療該病的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1）毒種：鴨坦布蘇病毒（DTMUV）JL2011 株，由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所獸醫研究室分離、保存。

2）鴨坦布蘇病毒病滅活苗：由本實驗室制備，將DTMUV JL2011 株接種SPF 雞胚，按常規方法[6]制備成油乳劑滅活苗，每毫升疫苗至少含滅活前的鴨坦布蘇病毒106.0 EID50，質量檢驗合格，備用。

3）SPF 雞胚：由北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司提供的SPF 種蛋，在實驗室孵育至9日齡，備用。

4）SPF 蛋雞：由北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司提供的SPF 種蛋，在實驗室孵育至所需日齡，隔離飼養備用。

5）雛鴨：由湖北宜城某養殖場提供種蛋，在實驗室孵育至7日齡，且鴨坦布蘇病毒抗體為陰性者用于試驗。

1.2 試驗方法

1）蛋雞的免疫及高免雞蛋的收集。用DTMUV滅活苗免疫接種90日齡SPF 蛋雞50 只。首免，每只雞肌肉注射滅活苗1.5 mL；間隔14 d 后進行第2 次免疫，每只雞2.0 mL；二免后間隔14 d 進行第3 次加強免疫，每只雞2.0 mL。第3 次加強免疫后第14 天開始收集雞蛋。做好記錄和標記，置于4~8 ℃儲存備用。

2）卵黃抗體（IgY）的提取。將收集的雞蛋用清水沖洗干凈后，浸入水溫42 ℃的0.1%新潔爾滅水溶液中消毒15~20 min，隨后將雞蛋用福爾馬林密閉熏蒸消毒30 min。采取手工打蛋，充分除去蛋清、胚盤和系帶，收集卵黃于一潔凈容器內，充分攪拌使蛋黃呈均勻膏狀，然后加入等體積經65 ℃30 min消毒并冷卻的蒸餾水，攪拌混勻后，60~65 ℃加熱滅活8~15 min。先加入相當于原卵黃體積4 倍，用鹽酸調pH 為4.2 的蒸餾水，將水溫降至1~4 ℃，加入滅活的蛋黃液，邊加邊攪拌，之后4~8 ℃保溫靜置4 h，離心分離上清液；加入辛酸至終濃度為0.02%，攪拌混勻，室溫靜置2~4 h。用尼龍濾布粗濾，再用超濾膜過濾濃縮，備用，取樣待檢。

3）雞胚中和試驗。用滅菌生理鹽水將萃提的IgY 做10、102、103、104、105、106倍稀釋，分別與100倍ELD50的鴨坦布蘇病毒等比混合，37 ℃作用1 h，接種10日齡SPF 雞胚，0.2 mL/枚，各5 枚，同時設病毒對照組和102倍稀釋的未免疫的SPF 雞蛋卵黃對照組，7 d 內觀察雞胚死亡情況，用Reed-Muench法計算卵黃抗體中和效價。

4）凍干。取萃提后無菌檢驗合格的IgY 溶液加入脫脂牛奶、蔗糖等作為穩定劑，充分搖勻，定量分裝，迅速進行冷凍真空干燥（按《中華人民共和國獸用生物制品規程》2000年版附錄進行）。

5）IgY 凍干前后的效價檢測。隨機抽取凍干前后各3 瓶樣品，采用間接ELISA 方法[7]檢測其效價，同時設非免疫雞蛋的卵黃作為對照。

6）攻毒保護試驗。將20 只健康7日齡雛鴨隨機分成2 組，IgY 免疫組10 只，對照組10 只，免疫組每只雛鴨皮下接種制備的凍干卵黃抗體0.5 mL，24 h 后免疫組和對照組均肌肉注射DTMUV 強毒株，隔離飼養，觀察14 d。

2 結果與分析

2.1 雞胚中和試驗

將第2 次免疫后2 周到第3 次免疫后8 周收集的雞蛋分為9 組，分別取樣進行雞胚中和試驗。結果標明，第3 次免疫后2 周IgY 溶液的雞胚中和效價達到1∶103.5，與鄒曉娟[8]研究結果高度一致；三免后4 周、5 周達到最高（1∶104.5），有效中和效價一直持續到三免后7 周，8 周下降至1∶103.0（圖1）。

圖1 DTMUV 滅活苗免疫蛋雞后IgY 抗體消長規律

2.2 IgY 凍干前后的效價檢測

間接ELISA 方法檢測結果如圖2，凍干前（免疫組1~3）、凍干后（凍干卵黃組1~3）的特異性明顯高于非免疫組，判定標準為S/N≥2.1 為陽性。說明IgY凍干前、后效價保持一致，凍干對效價沒有影響。

圖2 鴨坦布蘇病毒卵黃抗體凍干前后的效價檢測結果

2.3 攻毒保護試驗

IgY 免疫組10 只鴨免疫卵黃抗體24 h 后，肌肉注射DTMU 毒株后第3 天有2 只鴨出現減食、精神萎靡、腹瀉等癥狀，持續2~3 d 后逐漸恢復正常，未出現死亡，保護率達100%，觀察14 d 后對鴨進行剖檢，均無肉眼可見的病理變化；對照組的10 只雛鴨在攻毒后3 d 開始出現減食、精神萎靡、腹瀉等癥狀，并有部分鴨出現轉圈、運動失調等神經癥狀，隨后陸續死亡8 只，死亡鴨剖檢均可見肝臟腫大、淤血、壞死、脾臟腫大、心肌岀血等病理變化，觀察14 d 后，剖檢發病未死亡的2 只鴨，可見肝臟、脾臟腫大等病理變化，保護率20%（表1）。

表1 凍干卵黃抗體的攻毒保護試驗結果

3 討 論

1）本研究用鴨坦布蘇病毒病滅活苗三次免疫產蛋雞，收取高免雞蛋，將萃提的IgY 溶液制成凍干制劑后，其效價沒有發生改變，克服了常規水劑卵黃抗體的缺陷，具有質量穩定、副作用小、無殘留、易于保存、運輸方便等優點，為鴨坦布蘇病毒的防控提供了一種有效的凍干高免卵黃抗體制劑。

2）間接ELISA 方法是血清學中較常用的檢測方法之一，具有特異性強、靈敏度高及檢測速度快等特點，目前廣泛應用于動物的疾病診斷及疫苗效果的評價方面，本試驗證明也可用于卵黃抗體的免疫效價評價，與施少華等[7]研究結果相吻合。

3）本研究制備的凍干卵黃抗體對7日齡雛鴨的免疫攻毒保護試驗結果表明，未免疫卵黃抗體健康雛鴨的發病率達100%，死亡率達80%；而卵黃抗體免疫組的死亡率為0%，保護率達100%，說明卵黃抗體能夠有效保護鴨坦布蘇病毒強毒的攻擊。凍干卵黃抗體對產蛋鴨的免疫攻毒保護試驗及臨床應用效果有待于下一步研究。

4）鴨坦布蘇病毒病一年四季均可發生，在防控中使用高免卵黃抗體時應注意以下幾點：①早發現、早診斷、早治療；②疫苗免疫失敗后可用高免卵黃抗體緊急預防接種加以控制，減少死亡；③注射高免卵黃抗體時為防止局部感染，可同時投喂2~3 d的廣譜抗生素效果更好。