不同提取液對牛至粉中香芹酚和麝香草酚提取效果分析

馬建民 段素云 劉 瑩 郭 彤

北京農業職業學院，北京102400

牛至（Origanum vulgareL.）為唇形科牛至屬多年生草本植物，我國主要分布西北、東北、江西、安徽、湖北、河南等地，本品性涼、味辛、無毒，具有清熱解表、利水消腫的功效，主治中暑、感冒、頭痛身痛、急性胃腸炎、腹痛吐瀉、水腫等癥[1]。藥理研究表明，牛至精油具有抗菌、抗氧化[2]、增強免疫力作用，是牛至產生藥效的主要活性部位，其主要成分為香芹酚和麝香草酚。牛至精油的提取方法主要有有機溶劑提取、水蒸氣提取和超臨界流體萃取[3]等方法。牛至精油不溶于水、易揮發，可應用環糊精、羧甲基纖維素、海藻鈉等輔料進行包膜制成牛至精油預混劑進行使用[4-6]，通過包膜技術減少精油的揮發并增加其溶解性。劉元元等[7]使用5%牛至香酚預混劑，添加量為15 mg/kg，飼料中牛至香酚含量為0.75 mg/kg，促進肉雞生產性能。彭青云等[8]使用至多興牛至油添加劑，其香芹酚和麝香草酚含量分別為2.2%和1.1%，添加量為300 mg/kg，飼料中總酚含量為9.9 mg/kg，能改善肉雞的生產性能和屠宰性能并提高免疫器官指數。郝丹丹等[9]使用購自美國Sigma-Aldrich 公司牛至油，其中香芹酚7.3%、麝香草酚0.18%，最佳添加量為50 mg/kg，飼料中總酚含量為3.74 mg/kg，提高蛋雞的生產性能和免疫功能。市售牛至精油產品均以香芹酚和麝香草酚作為質量控制指標，當家禽飼料中總酚濃度為0.75~9.90 mg/kg時，可提高家禽的生產性能。牛至其他部位的藥效也有報道，早克然·司馬義等[10]發現牛至水提取物具有抗炎、止咳及抗自由基作用。李定剛等[11]對不同工藝來源的牛至提取物對小鼠大腸桿菌的防治作用的研究表明，牛至精油與牛至水提物混合使用防治效果最佳。

由于精油的化學性質，牛至的水提液中精油成分含量極低，而牛至精油的單獨提取相對復雜，提取后需進行包膜使用，且損失了牛至水提液中部分抗炎、抗氧化成分。本試驗在純化水中添加食品級助溶劑丙二醇或環糊精對牛至進行提取，以乙腈提取作為陽性對比，純化水提取作為陰性對比，通過高效液相色譜測定提取液中精油成分香芹酚和麝香草酚含量，評價丙二醇、環糊精對牛至精油成分輔助提取作用，為牛至產品開發提供新的提取方法。

1 材料與方法

1.1 試 劑

牛至購自玉林市玉州區菩提藥源食品經營部；丙二醇、β-環糊精、羥丙基-β-環糊精（食品級）購自九州食品配料商城；香芹酚、麝香草酚（＞99.0%）購自macklin 公司；乙腈（為色譜純）購自Fisher Scientific 公司。

1% β-環糊精溶液：精密稱取β-環糊精10.00 g，加蒸餾水1 000 mL 溶解；1%羥丙基-β-環糊精溶液：精密稱取羥丙基-β-環糊精10.00 g，加蒸餾水1 000 mL 溶解；10%丙二醇溶液：精密稱取丙二醇100 g，加蒸餾水溶解定容至1 000 mL；標準儲備液：分別精密稱取香芹酚和麝香草酚對照品0.0250 g，用乙腈定容至25 mL，制得終濃度為1 mg/mL 的2種標準儲備液。混合標準工作液：取以上2 種標準儲備液，用乙腈-水（40∶60）稀釋制備1、5、10、20、50 mg/L 5 個系列質量濃度的混合標準工作液，存放于4 ℃冰箱。

1.2 儀 器

電子分析天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司SQP）、昆山KQ-500DV 超聲清洗機、GT10-1型高速離心機（北京時代北利離心機有限公司）、震蕩器（IKA）、高效液相色譜儀（島津LC-16AT）。

1.3 提取方法

牛至粉碎后，過0.15 mm 篩，精確稱取3 份牛至粉末0.200 0 g，置10 mL 離心管中，分別加入5 mL提取液，密封，40 ℃超聲40 min，6 000 r/min 離心10 min，上清液即為牛至提取液。

1.4 色譜方法

色譜柱InertSustain C18（150 mm×2.1 mm，3 μm）；紫外檢測波長276 nm；流動相為乙腈-水（40∶60）；柱溫：50 ℃；流速0.4 mL/min；混合標準工作液依次進樣10 μL。將測得香芹酚和麝香草酚的色譜峰面積（A）和相對應的濃度（C）做直線回歸，求得標準曲線回歸方程的線性范圍和相關系數。

1.5 提取液中香芹酚和麝香草酚檢測

取1.3 上清液過微孔濾膜，量取濾液0.6 mL，加入乙腈0.4 mL，渦動5 min，10 000 r/min 離心10 min，取上清液過微孔濾膜，濾液上機檢測，進樣10 μL。按峰面積標準曲線法計算提取液中香芹酚和麝香草酚含量。

1.6 數據處理

試驗數據采用SPSS 19.0 統計軟件進行方差分析，極顯著水平為P＜0.01。試驗結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 標準曲線和液相色譜圖

混合標準工作液和牛至樣品色譜圖見圖1和圖2，香芹酚和麝香草酚基本完全分離，色譜峰形對稱。香芹酚和麝香草酚的標準曲線方程和相關系數見表1。

圖1 混合標準工作液色譜圖

圖2 牛至樣品色譜圖

表1 標準曲線和相關系數

2.2 提取液中香芹酚和麝香草酚含量

由表2可知，不同提取液中香芹酚和麝香草酚含量均差異極顯著（P＜0.01）。

表2 不同提取液中香芹酚和麝香草酚含量

3 討 論

3.1 液相色譜檢測

香芹酚與麝香草酚為同分異構體，分離較為困難，其化學名稱分別為2-甲基-5-異丙基苯酚和5-甲基-2-異丙基酚，竇茂鑫等[12]使用甲醇-水-冰醋酸（60∶40∶2）為流動相對飼料添加劑中的香芹酚與麝香草酚進行檢測分析。孫麗娟等[13]使用乙腈-水（50∶50）為流動相對牛至藥材中的香芹酚與麝香草酚進行分析。在文獻基礎上，本試驗采用乙腈-水（40∶60）的流動相對提取液進行分析檢測，色譜峰分離完全，出峰時間適宜，相關系數符合要求。可以通過標準曲線法計算提取液中香芹酚和麝香草酚含量，進行比較分析。

3.2 不同提取液比較

牛至中揮發油類成分香芹酚和麝香草酚是其抗菌、抗氧化的主要成分，因此用提取液中香芹酚和麝香草酚含量高低評價提取液的提取效果。香芹酚和麝香草酚結構決定其不易溶于水，易溶于有機溶劑，因此乙腈提取液含量最高分別為15.54 mg/L 和24.61 mg/L，蒸餾水提取液含量最低分別是0.29 mg/L和2.36 mg/L，牛至中香芹酚和麝香草酚含量測定一般使用乙腈進行提取[13]。純化水中添加環糊精和丙二醇提高香芹酚和麝香草酚的含量，其中1% β-環糊精提取液含量最高分別為13.62 mg/L 和17.10 mg/L，達到乙腈的87.64%和69.45%。環糊精具有“內親油、外親水”的空腔結構，提高了牛至精油成分溶解度和溶出速率，進而提高提取率[14]。

牛至粉在蒸餾水中香芹酚和麝香草酚溶出率極低，飼料中直接添加牛至粉的報道較少。1% β-環糊精牛至提取液與飼料進行1∶（3~10）比例拌料使用，飼料中總酚含量可達到3.07~10.24 mg/kg，與市售牛至油預混劑的濃度相當[7-9]。牛至1% β-環糊精提取液制備與提取牛至揮發油再制成牛至油預混劑的工藝相比，具有操作簡單、成本低的優點。

4 結 論

牛至β-環糊精提取液顯著提高了牛至中香芹酚和麝香草酚溶出度，可直接進行拌料使用，應用于畜牧養殖業。