耐鎘鄰苯二甲酸二辛酯降解菌的篩選及特性研究

劉標(biāo)，喻孟元，王震，杜東霞，陳薇，許麗娟，吳迎奔，吳民熙，劉惠知，尹紅梅

（湖南省微生物研究院，長(zhǎng)沙 410009）

鄰苯二甲酸酯（又稱(chēng)酞酸酯，Phthalic acid ester，PAEs），是塑料制品中常用的增塑劑，被普遍應(yīng)用于玩具、化妝品、食品包裝材料、醫(yī)療用具、建筑裝飾等行業(yè)的數(shù)百種產(chǎn)品中[1]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年的使用量達(dá)600 萬(wàn)～800 萬(wàn)t[2]。鄰苯二甲酸酯在各種塑料制品中主要依靠氫鍵、范德華力結(jié)合在母體上，連接不牢固，易在塑料制品的生產(chǎn)、使用過(guò)程中釋放到環(huán)境中[3-4]。目前在土壤、水體、水體沉積底泥，甚至動(dòng)植物中都檢測(cè)出鄰苯二甲酸酯[5-9]。鄰苯二甲酸酯是一類(lèi)內(nèi)分泌干擾物，在動(dòng)物體中表現(xiàn)出類(lèi)似性激素的作用，主要危害動(dòng)物的呼吸、生殖系統(tǒng)。隨著農(nóng)業(yè)規(guī)模化的發(fā)展，農(nóng)田土壤中鄰苯二甲酸酯含量越來(lái)越高，對(duì)人類(lèi)健康存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)。目前鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸二辛酯（DOP）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（BBP）和鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）等6 種鄰苯二甲酸酯被美國(guó)環(huán)境保護(hù)署、歐盟、中國(guó)國(guó)家環(huán)境監(jiān)測(cè)中心列為優(yōu)先控制有機(jī)污染物[10]。PAEs 在環(huán)境中的自然降解速率較慢，而添加PAEs 降解微生物可大幅提高其降解速率[11-12]，同時(shí)，由于微生物降解技術(shù)具有價(jià)格低廉、易操作等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是較有前景的修復(fù)技術(shù)之一，成為目前的研究熱點(diǎn)。目前，已分離篩選到大量能夠降解鄰苯二甲酸酯的微生物菌株，如假單胞菌、戈登氏菌、節(jié)桿菌、鐮刀菌、紅球菌等[7，13-17]，但大部分微生物菌株主要是以單一的鄰苯二甲酸酯為降解對(duì)象而篩選獲得的，而實(shí)際環(huán)境中往往存在多種復(fù)合污染物，因此，篩選出能夠適應(yīng)復(fù)合污染環(huán)境且具有PAEs降解功能的微生物菌株具有重要的研究意義和實(shí)用價(jià)值。

本研究以長(zhǎng)側(cè)鏈的DOP 為降解對(duì)象，篩選具有一定重金屬鎘耐受性的微生物降解菌株，并對(duì)菌株的降解特性進(jìn)行研究，期望為重金屬鎘和DOP復(fù)合污染的農(nóng)田土壤修復(fù)提供微生物資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑

DMP、DBP、DEP、DOP、DEHP、PA（鄰苯二甲酸）均購(gòu)自國(guó)藥試劑有限公司，純度＞99%；試驗(yàn)中其他化學(xué)試劑為分析純，有機(jī)溶劑均為色譜級(jí)。

1.2 微生物來(lái)源及相關(guān)培養(yǎng)基

微生物分離樣品為湖南省長(zhǎng)沙市望城區(qū)和瀏陽(yáng)市采取的農(nóng)田土壤。

含鎘無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（Mineral salt medium，MSM）：K2HPO45.8 g·L-1，KH2PO44.5 g·L-1，（NH4）2SO42.0 g·L-1，NaCl 0.75 g·L-1，MgCl20.16 g·L-1，CaCl20.02 g·L-1，CdCl20.05 g·L-1，F(xiàn)eCl30.002 g·L-1，pH 7.0。

各底物培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入甲醇溶解的DMP、DBP、DEP、DOP、DEHP、PA母液，水浴加熱使甲醇揮發(fā)，待甲醇完全揮發(fā)后再加入MSM 配制成所需濃度的各種底物培養(yǎng)基。

1.3 耐鎘DOP高效降解微生物的分離篩選

稱(chēng)取土壤樣品5 g 置于裝有100 mL 含鎘MSM 培養(yǎng)基的三角瓶中，MSM 培養(yǎng)基中添加終濃度為100 mg·L-1DOP 的甲醇溶液，待甲醇溶液揮發(fā)后，在30 ℃、180 r·min-1搖床中遮光振蕩培養(yǎng)7 d，然后取1 mL 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到下一DOP 濃度的MSM 培養(yǎng)基中，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)7 d。以此相同步驟進(jìn)行馴化培養(yǎng)，DOP 濃度分別為200、300、400、500、600 mg·L-1，共馴化6個(gè)周期，獲取既耐鎘又對(duì)DOP具有降解能力的菌液。通過(guò)稀釋涂布平板法在固體MSM 培養(yǎng)基平板上篩選單菌落，并通過(guò)四分區(qū)劃線法進(jìn)一步純化單菌落。將分離獲得的各菌株在MSM 試管斜面上培養(yǎng)7 d，4 ℃低溫保存待用。

1.4 初篩菌株對(duì)DOP降解能力的測(cè)定

將初篩獲取的5 株菌株接種在MSM 培養(yǎng)基（DOP 500 mg·L-1）中，30 ℃、180 r·min-1活化培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，MSM 液體培養(yǎng)基重懸各菌體，使菌液濃度OD600約為0.2，即為各菌株的種子液。分別接種1 mL 各菌株的種子液到初始DOP 濃度為500 mg·L-1的MSM 培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1遮光培養(yǎng)，分別在第96、120 h 測(cè)定各培養(yǎng)液中剩余的DOP 含量，以不接種的空白培養(yǎng)基為對(duì)照，計(jì)算各菌株對(duì)DOP的降解率。

利用高效液相色譜法測(cè)定菌液中的DOP 含量，采用外標(biāo)法定量，在選定的色譜條件下進(jìn)樣，以峰面積對(duì)DOP 濃度構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品前處理方法：在培養(yǎng)液中加入50 mL 二氯甲烷萃取，收集有機(jī)相，重復(fù)萃取兩次。將兩次萃取液合在一起，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上將二氯甲烷蒸發(fā)接近干燥，然后加入10 mL 甲醇溶解萃取物，經(jīng)0.22 μm 有機(jī)相過(guò)濾器過(guò)濾后，用高效液相色譜儀（HPLC，Agilent公司）測(cè)定DOP含量。

HPLC 條件：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-18（200 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相甲醇∶水=95∶5，進(jìn)樣量20 μL，柱溫35 ℃，流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)228 nm。

1.5 高效降解菌PD-2的菌種鑒定

利用平板劃線法在含DOP的MSM 平板上接種菌株P(guān)D-2，培養(yǎng)4 d后觀察其菌落形態(tài)特征和顯微形態(tài)特征。

菌株16S rDNA 序列分析：用Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株P(guān)D-2的基因組DNA，采用通用引物27F 和1492R 進(jìn)行16S rDNA 序列的擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃，45 s；56 ℃，45 s；72 ℃，90 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用膠回收試劑盒純化回收，委托上海生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)得的序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，通過(guò)Mega 5.0軟件中Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，確定該菌的分類(lèi)地位。

1.6 菌株P(guān)D-2降解特性研究

1.6.1 菌株P(guān)D-2的生長(zhǎng)曲線及降解動(dòng)力學(xué)曲線

將PD-2 的種子液，按1%接種量（V/V）加至MSM液體培養(yǎng)基中，DOP 初始濃度為500 mg·L-1，30 ℃、180 r·min-1遮光振蕩培養(yǎng)，分別在12、24、36、48、72、96、120、144 h 取樣測(cè)定菌液的OD600和剩余的DOP 含量，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.6.2 不同初始DOP濃度對(duì)菌株P(guān)D-2降解能力的影響

在MSM 培養(yǎng)基中加入DOP 溶液，使其初始濃度分別為100、200、300、400、500、600、800、1 000、1 200 mg·L-1，按1%接種量接種PD-2 種子液，30℃、180 r·min-1遮光振蕩培養(yǎng)4 d 后測(cè)定菌液中剩余的DOP 含量，以不接菌作為空白對(duì)照，計(jì)算第4 d的降解率。

1.6.3 菌株P(guān)D-2鎘耐受能力測(cè)定

配制含鎘濃度分別為100、200、400、600、800、1 000、1 500、2 000 mg·L-1MSM（DOP 初始濃度為500 mg·L-1）培養(yǎng)基，按1%接種量接種PD-2 種子液，30 ℃、180 r·min-1遮光振蕩培養(yǎng)4 d 后測(cè)定菌液的OD600，每個(gè)處理重復(fù)3次，探究菌株對(duì)鎘的耐受能力。

1.6.4 菌株P(guān)D-2對(duì)不同碳源底物的利用

在MSM 培養(yǎng)基中分別添加DMP、DBP、DEP、DEHP、PA、DOP 作為碳源底物，初始濃度均為500 mg·L-1，接種PD-2 后按相同條件培養(yǎng)4 d，測(cè)定各菌液的OD600，每個(gè)處理重復(fù)3 次，探究菌株對(duì)不同碳源的利用能力。

1.7 高效降解菌株在DOP污染土壤中的應(yīng)用

試驗(yàn)所用土壤為農(nóng)田水稻土（未檢出DOP），參考《土壤農(nóng)化分析》[18]中的方法測(cè)定理化性質(zhì)：有機(jī)質(zhì)19.8 g·kg-1，全氮0.68 g·kg-1，全磷0.84 g·kg-1，全鉀5.78 g·kg-1，鎘0.41 mg·kg-1，pH 6.53，土樣經(jīng)自然風(fēng)干過(guò)20目篩后備用。將200 g 土壤置于500 mL 錐形瓶中，添加DOP 溶液，調(diào)節(jié)終濃度約為100 mg·kg-1，配制成人工污染土壤。接種PD-2 的種子液到土壤中，終濃度約為1.0×108CFU·g-1，以不接種的土壤為空白對(duì)照組，將錐形瓶放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)，分別在0、5、10、15、20、25、30 d時(shí)取樣測(cè)定剩余DOP含量。

土壤樣品中DOP 含量的檢測(cè)[19]：取土壤樣品1.0 g 放入玻璃離心管中，加入30 mL 丙酮/己烷（V/V，1∶1）混合溶液，超聲提取10 min，靜置后收集有機(jī)相，重復(fù)以上步驟3 次，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干后，加入5 mL 甲醇溶解（加標(biāo)回收率約為93%）。將提取液過(guò)0.22 μm 有機(jī)相濾膜，過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至色譜瓶中，檢測(cè)方法同1.4節(jié)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003軟件對(duì)3次平行實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行繪圖，利用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差（ANOVA）統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐鎘DOP降解菌的篩選

隨著化肥、農(nóng)藥和農(nóng)用塑料地膜等生產(chǎn)物資的大量使用，我國(guó)農(nóng)田土壤表現(xiàn)出越來(lái)越明顯的復(fù)合污染，鎘和鄰苯二甲酸酯就是其中一種典型代表[20]。本研究通過(guò)選擇培養(yǎng)基的富集、馴化，分離獲得5 株既能耐受一定濃度的重金屬鎘，又能以DOP 為唯一碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌菌株。在初始DOP 濃度為500 mg·L-1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)120 h 后，5 株菌株均對(duì)DOP 有較明顯的降解作用。其中，菌株P(guān)D-2的降解率達(dá)到93.1%，顯著高于其他菌株（表1），且該菌株在血平板上不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，因此，選擇PD-2進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表1 不同菌株對(duì)DOP的降解能力Table 1 The ability of different strains on the DOP degradation

2.2 菌株P(guān)D-2的鑒定

菌株P(guān)D-2在含DOP的MSM固體培養(yǎng)基上形成的菌落較小，表面光滑、濕潤(rùn)，有光澤、不透明，邊緣整齊。在油鏡下，PD-2的菌體呈不規(guī)則的卵球形，單個(gè)或多個(gè)排列在一起，不形成芽孢，革蘭氏染色陰性（圖1）。

圖1 菌株P(guān)D-2菌落形態(tài)及顯微形態(tài)特征Figure 1 Colony morphology and micromorphological characteristics of strain PD-2

PCR 擴(kuò)增獲得PD-2 的16S rDNA 序列長(zhǎng)度為1 380 bp（Genbank 登錄號(hào)：MT071604），將其與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列進(jìn)行同源性比對(duì)，菌株與Hyphomicrobium facile（NR_027610.1）有很高的相似性（99%），基于其16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2 所示。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征和16S rDNA 序列分析的結(jié)果，初步將菌株P(guān)D-2 鑒定為生絲微菌。據(jù)報(bào)道，生絲微菌（Hyphomicrobiumsp.）主要用于合成吡咯喹啉醌[21]、降解甲胺磷、乙酰甲胺磷、水氨硫磷等農(nóng)藥[22]，本研究為首次將生絲微菌應(yīng)用于DOP 污染土壤修復(fù)。

2.3 菌株P(guān)D-2的生長(zhǎng)曲線及其對(duì)DOP的降解效應(yīng)

圖2 菌株P(guān)D-2的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 2 Phylogenetic tree of strain PD-2

如圖3 所示，菌株P(guān)D-2 在0～36 h 生長(zhǎng)較慢，培養(yǎng)基中的DOP 含量下降也較為緩慢，說(shuō)明該菌株在含DOP 的環(huán)境中適應(yīng)期較長(zhǎng)。36～72 h 是菌株P(guān)D-2 的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，DOP的含量在此期間迅速降低。72 h后菌株進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，此時(shí)DOP 含量略有下降，第96 h 時(shí)DOP 下降至45.3 mg·L-1，降解率達(dá)到最大，為90.9%。96 h 以后進(jìn)入衰退期，DOP 的含量不再有明顯變化。結(jié)合菌株的生長(zhǎng)及降解曲線可知，菌株對(duì)DOP的降解依賴(lài)于其生物量的增加，可能是因?yàn)榫暝贒OP 的誘導(dǎo)下通過(guò)分泌酯酶、鄰苯二甲酸降解相關(guān)酶[10]實(shí)現(xiàn)對(duì)DOP的降解，而酶的分泌與菌株的生長(zhǎng)代謝密切相關(guān)。

2.4 PD-2對(duì)不同初始濃度DOP的降解效果

PD-2 對(duì)不同初始濃度DOP 的降解效果（圖4）顯示，當(dāng)DOP 初始濃度低于800 mg·L-1時(shí)，4 d 內(nèi)PD-2對(duì)DOP 的降解率均超過(guò)90%，說(shuō)明菌株對(duì)DOP 具有較強(qiáng)的耐受性。當(dāng)DOP 濃度繼續(xù)提高時(shí)，降解率有較明顯的下降，這一結(jié)果與韓蕊等[23]、楊婧等[24]報(bào)道的菌株降解PAEs 的特性類(lèi)似，原因可能是高濃度的DOP會(huì)對(duì)PD-2的生長(zhǎng)繁殖或相關(guān)酶的分泌產(chǎn)生不利影響，從而影響菌株對(duì)其分解利用。

圖3 菌株P(guān)D-2利用DOP的生長(zhǎng)降解曲線Figure 3 The growth curve and DOP degradation curve of strain PD-2

圖4 不同初始DOP濃度對(duì)PD-2降解能力的影響Figure 4 Effect of different initial DOP concentration on the biodegradation of PD-2

2.5 菌株P(guān)D-2的鎘耐受性

如圖5 所示，在鎘濃度為0～600 mg·L-1時(shí)，菌株P(guān)D-2的生長(zhǎng)均較好，且無(wú)顯著差異，菌株具有相對(duì)較強(qiáng)的鎘耐受性。隨著培養(yǎng)基中鎘濃度的增加，PD-2仍能生長(zhǎng)，但生物量顯著減少，說(shuō)明高濃度的鎘對(duì)菌株生長(zhǎng)有一定抑制作用，在鎘重度污染區(qū)菌株P(guān)D-2對(duì)DOP的修復(fù)效率會(huì)顯著降低。

2.6 菌株P(guān)D-2對(duì)不同碳源底物的利用

培養(yǎng)4 d 后，菌株P(guān)D-2 在6 種底物液體培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)狀況不同。其在含短側(cè)鏈酞酸酯底物（DMP、DEP、DBP）的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好，在長(zhǎng)側(cè)鏈酞酸酯底物（DEHP、DOP）的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)相對(duì)較慢（表2）。這一結(jié)果與先前報(bào)道的菌株寡養(yǎng)假單胞菌B3[25]、分枝桿菌ASW6D[24]、Gordoniasp.JDC-2[26]特性類(lèi)似。在實(shí)際污染環(huán)境中往往是多種鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物并存，菌株P(guān)D-2不僅可降解DOP，還可利用其他種類(lèi)的PAEs（表2），因此，該菌株在實(shí)際污染環(huán)境修復(fù)工程中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖5 鎘濃度對(duì)菌株P(guān)D-2生長(zhǎng)的影響Figure 5 Effect of Cd2+concentration on the growth of strain PD-2

2.7 菌株P(guān)D-2對(duì)土壤中DOP的降解效果

菌株P(guān)D-2在DOP污染土壤中降解效果如圖6所示，接種菌劑PD-2 到土壤30 d 后，DOP 的去除率達(dá)64%，而未接種的對(duì)照組為14.8%，說(shuō)明菌劑PD-2 可顯著提高土壤中DOP 的去除率。添加菌劑PD-2 的處理組DOP 的降解在前5 d 較緩慢，第5～10 d 降解速度顯著增加，10 d后降解速率又變得較為緩慢。原因可能是在接種菌劑前期，菌株P(guān)D-2 與土壤中土著微生物存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，其生長(zhǎng)代謝受到一定抑制；第5～10 d降解速率加快是因?yàn)镻D-2在與土著微生物的競(jìng)爭(zhēng)中逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)；后期降解速率變慢可能是因?yàn)镈OP在土壤中進(jìn)入緩慢吸附階段，其通過(guò)分配作用進(jìn)入土壤微孔內(nèi)或吸附在高能位點(diǎn)上，與土壤成分結(jié)合更加緊密，微生物對(duì)其降解也越困難[27]。

表2 菌株P(guān)D-2底物利用試驗(yàn)Table 2 The test of strain PD-2 using the substrates

圖6 PD-2對(duì)污染土壤中DOP的降解效果Figure 6 Biodegradation of DOP by PD-2 in soil

3 結(jié)論

（1）從農(nóng)田土壤中篩選出一株既耐受重金屬鎘又可高效降解利用DOP 的菌株P(guān)D-2，在DOP 初始濃度為500 mg·L-1的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)120 h 后，其對(duì)DOP 的降解率可達(dá)93.1%。綜合菌株形態(tài)特征和16S rDNA 序列，將該菌鑒定為生絲微菌屬（Hyphomicrobiumsp.），本研究首次將獲得的生絲微菌用于降解土壤中DOP。

（2）菌株P(guān)D-2 對(duì)液體培養(yǎng)基中DOP 的降解依賴(lài)于其生物量的增加，其對(duì)DOP 的作用濃度和耐鎘濃度范圍廣，可高效降解100～800 mg·L-1范圍的DOP（降解率大于80%），在含鎘濃度0～600 mg·L-1的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。PD-2 可利用其他常見(jiàn)PAEs 和鄰苯二甲酸作為底物生長(zhǎng)，底物種類(lèi)范圍廣。

（3）添加PD-2 到鎘和DOP 復(fù)合污染土壤中，其對(duì)DOP 的降解作用顯著，PD-2 在鎘和DOP 復(fù)合污染土壤的修復(fù)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。