環(huán)丙沙星和鎘復合污染土壤中鎘的生物可給性及其動態(tài)變化

郭劍波，常旭卉，陳龍，劉小茼，王淑平

（中國科學院大學資源與環(huán)境學院，北京 100049）

畜禽糞便作為有機肥料施入土壤后，其殘留的重金屬和抗生素不僅影響土壤肥力和作物的產(chǎn)量與品質(zhì)[1-2]，而且最終將通過食物鏈危害人類的健康[3]。土壤中的鎘（Cd）主要分布在地表0～20 cm 處[4]，且土壤中Cd 的環(huán)境容量小、毒性大[5]。2014 年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，我國耕地土壤點位超標率為19.4%，主要污染物為鎘、銅、鎳、砷、汞、鉛、滴滴涕和多環(huán)芳烴[6]。抗生素在動物體內(nèi)的分解較少，有30%～90%以母體化合物或代謝產(chǎn)物形式隨糞便排出體外[7-8]，使得畜禽糞便成為抗生素污染環(huán)境的主要途徑之一。Morales-Muoz等[9]借助動態(tài)微波輔助提取和在線實時監(jiān)測的方法對西班牙某污染土壤進行了檢測，發(fā)現(xiàn)在使用糞肥的土壤中環(huán)丙沙星和諾氟沙星的平均濃度分別為4.4 mg·kg-1和8 mg·kg-1。Zhao等[10]對采自中國8 個省（市、自治區(qū)）的大型畜禽養(yǎng)殖場的143 個畜禽糞便樣品進行了檢測，結(jié)果顯示所有樣品中均檢出環(huán)丙沙星，最大濃度為45.59 mg·kg-1。此外，研究表明畜禽糞便中殘留的高濃度抗生素和重金屬會引起養(yǎng)殖場及周邊土壤抗生素和重金屬的復合污染[11-13]。抗生素具有一個或多個官能團，并且這些官能團均可與金屬離子發(fā)生絡合作用，重金屬-抗生素的絡合作用不僅影響各自的環(huán)境行為和生物效應，而且在復合污染體系中對環(huán)境效應起主導作用，其聯(lián)合毒性存在協(xié)同、拮抗，甚至加和等復雜的毒理效應[14-16]。

人體暴露于環(huán)境中Cd的途徑主要包括食用受污染的食物或飲用水、吸入土壤或空氣中含Cd 顆粒物質(zhì)以及接觸Cd煙霧和灰塵[17-18]，其中無意的口部攝入特別是兒童戶外活動時經(jīng)手-口攝入被認為是土壤重金屬人體暴露的重要途徑之一[19-21]。在人體健康風險評價中，基于生理學的體外實驗（in vitro）模型是進行重金屬生物可給性評估的有效工具。生物可給性是指在人體胃腸環(huán)境中可溶并可供吸收的重金屬的含量，而生物有效性是指吸收到體內(nèi)重新分布的重金屬含量[22]。由于小腸對重金屬的不完全吸收，生物可給性一般大于生物有效性，但生物可給性在一定程度上能反映生物有效性。體外實驗具有操作簡單、快速，費用較低等優(yōu)點，因而受到國內(nèi)外研究者廣泛關注[23-25]。因此，利用體外實驗研究土壤環(huán)境樣品中重金屬Cd 人體生物可給性能夠更加準確地評價Cd 對人體健康的潛在風險。但目前有關Cd生物可給性的研究多集中在重金屬單一污染上，對于復合污染的研究相對較少。因此，本研究選取環(huán)丙沙星（Ciprofloxa?cin，CIP）和重金屬Cd 作為土壤污染物質(zhì)，基于PBET（Physiologically based extraction test）+SHIME（Simula?tor of human intestinal microbial ecosystems of infants）模型研究環(huán)丙沙星和Cd 復合污染土壤中Cd 的生物可給性，為評價土壤中抗生素和Cd 復合污染對人體健康的潛在風險提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

本研究所用的無污染土壤于2017 年采自河北省安新縣王家寨，供試土壤為潮土，按照中國土壤系統(tǒng)分類為干潤雛形土（Ustic cambosols）。采集0～20 cm土層土壤，土壤有機質(zhì)含量為26.3 g·kg-1，土壤pH 值為7.91，堿解氮含量為112 mg·kg-1。供試土壤未檢測出Cd和環(huán)丙沙星。

1.2 土壤老化試驗

采集新鮮土樣過2 mm篩，充分混勻，放置于人工氣候箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)一周，以活化土壤微生物。然后取土裝盆（培養(yǎng)盆規(guī)格：頂部直徑12.0 cm×底部直徑8.5 cm×高10.0 cm），每盆裝232 g 鮮土，培養(yǎng)盆中土壤含水量為田間最大持水量的70%左右，置于人工氣候箱中25 ℃非密閉培養(yǎng)，并模擬實際光照周期變化（晝夜各12 h），通過稱質(zhì)量法補充培養(yǎng)盆中土壤損失的水分，以保持土壤含水量恒定。

試驗共設置4 個處理：CK+Cd（外源添加Cd 80 mg·kg-1），CIPⅠ+Cd（外源添加CIP 5 mg·kg-1+Cd 80 mg·kg-1），CIPⅡ+Cd（外源添加CIP 25 mg·kg-1+Cd 80 mg·kg-1），CIPⅢ+Cd（外源添加CIP 50 mg·kg-1+Cd 80 mg·kg-1），3 次重復。Cd 添加量以目前已知肥料中含量為依據(jù)[26]，抗生素藥物添加量設定以已知畜禽糞便中CIP 的含量為依據(jù)[10]。試驗分別于土壤培養(yǎng)的第1、30、60 d 取樣。培養(yǎng)后的土壤樣品風干，一部分保存于4 ℃冰箱，用于土壤理化性質(zhì)測定，另一部分保存于-20 ℃冰箱，用于后續(xù)體外培養(yǎng)試驗。

1.3 體外模擬試驗

主要采用PBET+SHIME 模型中的方法，具體操作步驟如下：

（1）胃階段：配制模擬胃液（以配制600 mL 胃液為例，分別稱取檸檬酸0.3 g、蘋果酸0.3 g、乳酸252μL、冰乙酸300 μL 置于燒杯中，加水600 mL，用12 mol·L-1濃HCl 調(diào)pH 至1.5，再加胃蛋白酶0.75 g，混勻，添加NaCl 5.265 g），稱取土樣0.3 g 于50 mL 的離心管內(nèi)，將30 mL 模擬胃液和土樣混合于離心管內(nèi)，使得固液比為1∶100，每個樣品3 個平行，混勻微調(diào)pH（1.5±0.1）后，置于37 ℃、150 r·min-1的恒溫振蕩儀中（0.5 h 時測定pH）。在1 h 時，吸取反應液10 mL，以4 000 r·min-1的速度離心10 min，重復3 次，過0.45μm濾膜，-20 ℃保存待測。

（2）小腸階段：用NaHCO3粉末將胃階段反應液pH 調(diào)至7.0，加入胰酶0.018 g、膽鹽0.06 g，繼續(xù)置于37 ℃、150 r·min-1的恒溫振蕩儀中，2 h 時測定pH，并用1 mol·L-1HCl 或NaHCO3微調(diào)，使pH 維持在7.0±0.1。在4 h時，吸取反應液10 mL，離心，過0.45μm濾膜，-20 ℃保存待測。

（3）結(jié)腸階段：將小腸液轉(zhuǎn)移至100 mL 的厭氧血清瓶內(nèi)，并從SHIME模型的降結(jié)腸階段吸取30 mL菌液加入，使土液比為1∶100，迅速通入氮氣20 min 以保證厭氧條件，加蓋密封后繼續(xù)置于37 ℃、150 r·min-1的恒溫振蕩儀中。在48 h 時，吸取反應液10 mL，離心，過0.45μm濾膜，-80 ℃保存待測。

1.4 計算方法

土壤中重金屬Cd在模擬胃階段和腸階段的生物可給性計算公式如下：

式中：BA 為Cd 的生物可給性，%；CIV是模擬實驗中各階段Cd 的濃度，mg·L-1；VIV為各階段反應器中反應液的體積，L，本實驗為0.03 L；TS是土壤樣品中Cd 的總量，mg·kg-1；MS為加入反應器中的土樣的質(zhì)量，kg，本實驗為0.000 3 kg。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2016整理，使用SPSS 22.0進行單因素ANOVA 方差分析，采用Duncan方法進行顯著性檢驗，用Origin 2018軟件進行作圖。數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同老化時間復合污染土壤中Cd的生物可給性

2.1.1 第1 d重金屬Cd在胃腸階段的生物可給性

由圖1 可知，D1 復合污染土壤中不同濃度CIP 對Cd 在胃腸階段的生物可給性影響不同。胃階段各處理Cd生物可給性無顯著差異。在小腸階段，隨著CIP濃度的增加，重金屬Cd 的生物可給性呈逐漸降低的趨勢。在結(jié)腸階段，沒有檢出溶解態(tài)Cd。

圖1 第1 d不同處理在胃腸階段Cd的生物可給性Figure 1 Effects of CIP on the bioaccessibility of Cd among the gastric and small intestinal phase on Day 1

2.1.2 第30 d重金屬Cd在胃腸階段的生物可給性

由圖2 可知，D30 復合污染土壤中不同濃度CIP對Cd 在胃腸階段的生物可給性影響不同。胃階段CIPⅡ+Cd處理Cd生物可給性最大，相較于CK+Cd增加10.36個百分點，但差異不顯著（P＞0.05）；CIPⅠ+Cd處理和CIPⅢ+Cd處理生物可給性相較于對照處理分別增加5.82個百分點和5.33個百分點，但差異不顯著（P＞0.05）；在小腸階段，隨著CIP濃度的增加，Cd在小腸階段的生物可給性呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，但與對照處理之間差異均未達到顯著水平（P＞0.05）；在結(jié)腸階段，隨著CIP 濃度的增加，各處理的生物可給性呈現(xiàn)增加的趨勢，其中CIPⅢ+Cd處理Cd生物可給性最大，相較于對照處理顯著增加1.73 倍（P＜0.05），CIPⅡ+Cd處理相較于對照處理顯著增加1.56倍（P＜0.05）。

2.1.3 第60 d重金屬Cd在胃腸階段的生物可給性

圖2 第30 d不同處理在胃腸階段Cd的生物可給性Figure 2 Effects of CIP on the bioaccessibility of Cd among the gastric，small intestinal and colon phase on Day 30

由圖3 可知，D60 復合污染土壤中不同濃度CIP對Cd 在胃腸階段的生物可給性影響不同。胃階段CIPⅠ+Cd 處理生物可給性最大，為91.32%，相較于CK+Cd 增加3.82 個百分點，但差異不顯著（P＞0.05），CIPⅡ+Cd 處理和CIPⅢ+Cd 處理Cd 生物可給性相較于對照處理均降低，但差異不顯著（P＞0.05），高濃度的CIP 導致Cd 在胃階段的生物可給性降低；在小腸階段，隨著CIP 濃度的增加，Cd 的生物可給性呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，其中CIPⅢ+Cd 處理Cd 生物可給性最大，為31.30%，相較于對照處理顯著增加2.38 倍（P＜0.05），CIPⅡ+Cd處理Cd生物可給性相對于對照處理顯著增加1.60 倍（P＜0.05）；在結(jié)腸階段，隨著CIP 濃度的增加，各處理的生物可給性呈現(xiàn)增加的趨勢，其中CIPⅢ+Cd處理Cd生物可給性最大，為9.19%，各處理Cd生物可給性相較于對照處理差異均未達到顯著水平（P＞0.05）。

2.2 復合污染土壤中胃階段Cd的生物可給性動態(tài)變化

表1 為胃階段不同停留時間Cd 的生物可給性動態(tài)變化。通常，在PBET 方法中，土壤在胃階段的停留時間設定為1 h，因此，本研究考察了0～60 min胃階段Cd 生物可給性動態(tài)變化。由表1 可得，不同處理Cd 在胃階段生物可給性的變化不同，且隨著在胃中停留時間的增加，Cd 的生物可給性呈增加的趨勢，但增幅有所不同。胃階段停留20 min時，各處理土壤中Cd 的生物可給性變幅最大，Cd 生物可給性在停留60 min 時達到最大。各處理Cd 生物可給性變化均是先快后慢，在胃階段生物可給性的變化趨勢相似，而且同一停留時間不同處理間Cd生物可給性差異均不顯著（P＞0.05）。

圖3 第60 d不同處理在胃腸階段Cd的生物可給性Figure 3 Effects of CIP on the bioaccessibility of Cd among the gastric，small intestinal and colon phase on Day 60

3 討論

不同老化天數(shù)復合污染土壤中Cd的生物可給性有所差異。隨著土壤老化時間的延長，Cd 的生物可給性不斷降低，其潛在環(huán)境風險也相應地下降。研究表明，隨著老化時間的延長，土壤中有效態(tài)Cd 含量逐漸下降最后趨于穩(wěn)定[27-30]，而使其環(huán)境風險也相應降低。同時也有研究證明，喹諾酮類抗生素可以與很多金屬離子形成穩(wěn)定的絡合物，影響各自的生物效應[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)Cd 在小腸階段的生物可給性低于胃階段。可能是因為從胃階段到小腸階段in vitropH 升高，以及胰酶和膽鹽的加入，使得土壤對Cd 離子的吸附力加強，而且Cd 與其他金屬離子形成沉淀的機會增大，從而導致腸液中Cd 的濃度降低，這與其他眾多研究結(jié)果相一致[19-20，25]。復合污染各處理土壤中Cd 生物可給性與CK+Cd 相比有所不同，其原因可能是CIP 有多個官能團，并且這些官能團均可與金屬離子發(fā)生絡合作用，Cd-CIP 的絡合作用影響了Cd 的生物效應[33-34]。隨著CIP 濃度的增加，D30 胃階段Cd 的生物可給性呈逐漸增大的趨勢，可能是由于吸收了完整的CIP-Cd 復合物，該結(jié)果與黃日祥[35]研究四環(huán)素能促進金屬礦物溶解的結(jié)果一致，其研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素通過表面結(jié)合吸附到金屬礦物表面，從而促進金屬礦物的溶解。D30 小腸階段Cd 的生物可給性呈逐漸降低的趨勢，可能是因為CIP 與Cd 離子的絡合反應，在加入CIP 后引起土壤中游離態(tài)Cd 離子含量減少。小腸階段D60 各處理Cd 生物可給性與D30 各處理Cd 生物可給性變化趨勢相反，D60 小腸階段的Cd 的生物可給性相較于對照呈逐漸增加的趨勢，這可能是因為CK+Cd 處理土壤中Cd 的老化特征表現(xiàn)為有效態(tài)Cd 含量在30～60 d內(nèi)快速降低[29]，而且有研究表明不同濃度組合條件下，CIP 與Cd 反應會生成不同的絡合物[31，36]。此外，污染物在特定時間的生物可給性可能無法全面反映人體胃階段的動態(tài)溶解和吸收情況，因此本研究考察不同停留時間（20、40、60 min）生物可給性動態(tài)變化。結(jié)果顯示，各處理復合污染土壤中Cd 的生物可給性變化速率均呈先快后慢趨勢，與尹乃毅等[37]的研究結(jié)果基本一致。此外，在胃階段Cd 生物可給性動態(tài)變化研究中，由于in vitropH 較低，有利于土壤中Cd 的溶出，故20 min 時Cd 的生物可給性變幅均很高。不同老化天數(shù)條件下不同停留時間的生物可給性有所差異，這可能是因為CIP-Cd 有機物絡合態(tài)的溶解差異，而且土壤中金屬最先溶出的形態(tài)為可交換態(tài)，之后碳酸鹽結(jié)合態(tài)溶解會釋放出大量的Cd離子，而且各形態(tài)之間可能會相互轉(zhuǎn)化，進而影響金屬的溶出率。

表1 不同處理在胃階段Cd的生物可給性動態(tài)變化（%）Table 1 Dynamic dissolution of Cd in gastric phase under different treatments（%）

4 結(jié)論

（1）環(huán)丙沙星和Cd 復合污染土壤中Cd 的生物可給性在胃階段較高，在小腸和結(jié)腸階段較低。

（2）環(huán)丙沙星的添加對胃階段Cd 的生物可給性無顯著影響，而對小腸和結(jié)腸階段Cd 的生物可給性有一定的影響，與未添加環(huán)丙沙星的對照處理相比，添加25、50 mg·kg-1環(huán)丙沙星顯著提高了老化30 d 結(jié)腸階段和老化60 d小腸階段Cd的生物可給性。

（3）胃階段不同濃度環(huán)丙沙星與Cd 復合污染土壤中，Cd 的生物可給性隨停留時間的動態(tài)變化不同，但均呈先快后慢趨勢。