有機肥施加對紅壤中反硝化細菌nirK基因多樣性影響①

張晨陽，滕齊輝，曹 瀅，崔中利，李順鵬，曹 慧

有機肥施加對紅壤中反硝化細菌基因多樣性影響①

張晨陽，滕齊輝，曹 瀅，崔中利，李順鵬，曹 慧*

(南京農業大學生命科學學院/農業農村部農業環境微生物工程重點實驗室，南京 210095)

為了解有機肥施用對于紅壤中反硝化細菌群落結構的影響，設置了4個處理：CK(不施肥)、LM(低量有機肥)、ML(高量有機肥+石灰)和HM(高量有機肥)進行研究，并通過末端限制性片段長度多態性(T-RFLP)和克隆文庫的DNA測序估計了基因的多樣性。結果表明：各處理分別挑選的288個陽性克隆子可分為78個類型，各處理文庫中的優勢類群屬于同一種類型，在CK處理中的占比為51%，在其他3個處理中的占比依次為33%、32% 和27%。4個文庫之間兩兩的相似性在37.50% ~ 45.34%，系統進化樹分析表明，51個OTUs測序結果中6個OTUs與蒼白桿菌屬的相似性最高，占測序總數的11.8%；其余45個OTUs屬于未培養類型，占測序總數的88.2%。有機肥添加有助于提高基因的多樣性，并且出現了紅壤原始環境中未出現的反硝化細菌類型。

反硝化細菌；基因；RFLP 分析；紅壤；有機肥施加

紅壤在我國熱帶和亞熱帶地區廣泛分布，是我國最主要的土壤類型之一，在全國范圍內共有148萬km2，占耕地總面積的36%[1]。紅壤由于風化和淋溶作用，使得土壤的酸性較強、養分匱乏，缺乏許多營養元素，尤其是氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫、鋅和銅[2-3]。為了提高紅壤的肥力，通常采用有機肥來改善其質量，添加到土壤中的有機肥可以改善土壤性質，例如土壤團聚體、持水能力、土壤容重和肥力等[4-6]。康國棟等[7]研究發現有機肥的施加可以促進紅壤有機質活性組分的提高，對于土壤的培肥至關重要。石灰也常常被用來修復酸性土壤。在熱帶地區，施用少量的石灰就可以緩解鋁毒性和/或鈣缺乏狀況，從而增加作物產量[8]，石灰的施加對于紅壤中鉀的含量也有一定的影響[9]。由于紅壤在干濕環境下的特殊性質，容易滋生反硝化微生物[10]，而施肥被認為是土壤微生物演替的重要驅動因素[11]，包括化肥和有機肥在內的氮肥施用，可以促進硝化作用與反硝化作用，導致氮素的流失[12-14]。因此研究有機肥添加對于紅壤中反硝化細菌的影響有較大意義。

反硝化作用是氮循環中的關鍵組分，是在微氧或無氧環境中一種由微生物介導的逐步還原過程，其中硝酸鹽(NO– 3)依次還原為亞硝酸鹽(NO– 2)，一氧化氮(NO)，一氧化二氮(N2O)，最后還原為氮氣(N2)[15]。反硝化作用的4個生物過程對應著4種在反硝化過程中互相獨立的關鍵酶，分別是硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、氧化氮還原酶和氧化亞氮還原酶，對應的功能基因分別為、、和。而亞硝酸還原酶參與的反應是區分硝酸鹽呼吸菌和反硝化細菌的標志性反應，同時這一步反應還會釋放出臭氧被還原的催化劑氣體，因此是反硝化過程中的重要限速步驟[16-18]。亞硝酸還原酶具有兩種由不同基因(和)編碼的結構形態，許多研究將這兩種基因用于研究反硝化細菌群落。研究發現，含有基因的微生物以假單胞菌(sp)為主，而基因則存在于很多分布較遠的微生物中[17]；另外，也有研究發現基因對環境因子的變化相較于基因更為敏感，環境因子如NO– 3、全氮、含水量等的改變會影響含有基因的反硝化細菌的多樣性[19-20]。因此，研究環境中的基因可以更為真實地了解環境中反硝化細菌群落結構的情況，也有助于了解環境因子對于反硝化細菌群落的綜合作用。

有研究者發現，土壤中由于反硝化作用而損失的氮肥占其總量的20% ~ 30%[21]。氮肥是土壤氧化亞氮排放的主要來源，而這種氣體的排放導致全球氣候發生變化[22]，通過反硝化和氨揮發損失的氮素量隨氮肥用量的增加而增加[23]。在之前的研究中研究者對有機肥的施用方式與有機肥的類型對于反硝化細菌的影響進行了研究[12-14, 24]，但是對于紅壤中施用有機肥對于含有基因的反硝化細菌影響尚無定論。本研究利用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)技術研究長期(4年)施加有機肥和石灰的紅壤中基因群落結構的改變，探討紅壤地區反硝化細菌的多樣性及其重要影響因素，為紅壤陸地生態系統研究提供部分參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及樣品采集

采樣地點位于江西省鷹潭市的中國科學院紅壤生態實驗站內(116°55′30″ E，28°15′20″ N)，試驗土壤為第四紀紅黏土發育的紅壤(黏化濕潤富鐵土)，試驗小區為長2 m×寬2 m的水泥池，自2002年起，每年種植一季玉米(山東登海一號)。試驗使用養殖廠豬糞作為有機肥，設置4個處理：①CK，不施肥；②LM，低量有機肥，折合純N 150 kg/(hm2·a)；③ML，高量有機肥+石灰，折合純N 600 kg/(hm2·a) + 石灰1 000 kg/(hm2·a) (考慮到石灰處理對于土壤的影響及作用時間，2002年和2005年各施加一次石灰)；④HM，高量有機肥，折合純N 600 kg/(hm2·a)。每處理3個重復。2006年7月下旬收獲作物一周后進行土壤樣品采集，每個小區土壤樣品均為9點混合樣品，用不銹鋼土鉆(直徑2 cm) 鉆取0 ~ 15 cm的土樣，用四分法留取土樣，低溫冷藏帶回實驗室，去除石頭和植物根系，取一部分混合土壤樣品風干后過篩(<2 mm)用于理化性質測定；另取一部分保存于–70℃冰箱中用于土壤微生物總DNA提取。試驗土壤理化性質參見文獻[25]。

1.2 供試菌株與試劑

本試驗除大腸桿菌DH10B、限制性內切酶HhaI和RsaI購自大連寶生物工程有限公司外，其余所有在試驗中使用的菌株和試劑均與本實驗室之前的研究中使用的一致[26]。

1.3 反硝化細菌nirK基因片段的擴增與克隆文庫的構建

使用Zhou等[27]提出的直接提取法對土壤樣品總DNA進行提取。采用引物(5'- GGMATGG-TKCCSTGGCA -3')和(5'- GCCTCGATCAGR-TTRTGG -3')用于直接擴增土壤總DNA中的基因片段[28]。PCR反應體系與汪峰等[26]研究中使用的體系一致，PCR擴增程序采用“降落”PCR 程序。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，10 個循環，每個循環降0.5℃；后再接50℃退火30 s，72℃延伸1 min，10 個循環，每個循環升0.5℃； 52℃退火30 s，72℃延伸1 min，10 個循環，最后72℃延伸10 min。使用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的條帶大小和濃度，為了避免單次擴增帶來的偏差并獲得足夠的PCR產物用于克隆，對每個DNA樣品進行3次重復擴增，然后合并使用回收試劑盒回收純化目的片段，并根據制造商的方案克隆到pMD18-T載體中。將質粒轉化到感受態DH10B中，使用藍白斑篩選，從4個處理中各挑選出288個陽性克隆子，建立基因片段的克隆文庫，所有的克隆文庫驗證后轉移至96孔細胞培養板，加等體積的30% 甘油混合后于–70℃保存。

1.4 限制性內切酶片段長度多態性分析

直接挑取陽性轉化子菌體，使用菌體PCR的方式利用上述引物再次進行片斷的擴增，分別用HhaI和RsaI兩種限制性內切酶對PCR產物進行酶切(37 ℃，3 h)。使用8% 的聚丙烯酰胺凝膠電泳對酶切產物進行分離，經硝酸銀染色、凝膠成像整理后即為反硝化基因指紋圖譜。所得到的指紋圖譜用上海山富科技服務有限公司的(Bio-science)GIS凝膠成像分析系統分析并輔以人工分析。以基因片段多態圖像為基礎進行聚類，將兩種酶切產物帶型一致的基因型分為一類，每一個基因型即為一個操作分類單位(operational taxonomic unit，OTU)。

通過統計分析方法對4個處理進行多樣性比較，計算得到群落的文庫覆蓋率 (Coverage C)、香農指數、辛普森指數、均勻度和豐富度指數。

1.5 序列測定和系統發育樹構建

對4個處理文庫中的代表性酶切克隆子進行了測序，共挑取54個克隆子，測定其插入序列全長(515 bp左右)。測序工作由上海生工生物技術公司完成，測序引物為pMD18-T vector多克隆位點兩端的通用引物(primer RV-M 和primer M13-4)。將測序獲得的序列提交至NCBI(National Center for Biote-chnology Information)，得到登錄號為EU790823 ~ EU790873，使用BLAST對GenBank(http://www.ncbi. nlm.nih.gov)已經存在的序列進行同源性比對。經過嵌合體檢查后，將確定為反硝化基因的序列用BioEdit v7.0.1轉換成FASTA 格式。同時，根據BLAST同源性比對的結果，從核酸數據庫中下載同源性高的序列以及不同分類來源的代表性序列，然后按照汪峰等[26]研究中的方法進行系統進化樹構建，從而進行系統發育分析。

2 結果與分析

2.1 nirK基因文庫的酶切類型

對CK、LM、ML和HM 4個處理的土壤DNA進行PCR擴增，構建基因克隆文庫，通過RFLP分析發現，這些基因具有豐富的物種多樣性。根據獲得的清晰RFLP圖譜，各個處理分別挑選的288個克隆子可分為78種類型，并將這78種類型分別命名為CK-A至CK-N，LM-A至LM-S，ML-A至 ML-T和HM-A至HM-Y，4個克隆文庫聚類比例見表1。CK文庫中占比最大的類群即為其優勢類群，占比達到了51%，超過了CK文庫總數的一半，LM文庫中優勢類群所占比例為33%，ML文庫中優勢類群的比例為32%，HM文庫中優勢類群占總數的27%。優勢類群是這4個文庫中共有的，并且其相對含量隨著有機肥的添加而逐漸降低；在4個文庫中出現了部分特有的類型，從各處理類群數也可看出隨著肥力的增加反硝化細菌的類群是逐漸增加的。

表2是4個基因文庫之間的群落相似性矩陣，通過相似性比較可以看出不同的處理導致群落間變化的差異程度。4個文庫兩兩之間的相似性在37.50% ~ 45.34%；隨著有機肥添加量的增加相似性值下降。說明整體上4個處理依舊存在著很大的共性部分，但有機肥的添加可以改變反硝化細菌群落。

2.2 nirK基因文庫的多樣性指數

圖1是4個基因文庫的豐富度曲線，從圖1中可以看出，4個文庫的趨勢線已經趨于平緩，說明庫容量已經達到了比較飽和的程度。由表3可知，4個文庫的文庫覆蓋率分別為88.23%(CK)、86.57% (LM)、87.84%(ML)和80.82%(HM)，均大于80%，說明本研究所建立的基因文庫可以較好地代表紅壤環境中反硝化細菌的群落組成。

從4個文庫中的多樣性指數可以看出，紅壤中存在著豐富的反硝化微生物，各文庫之間多樣性指數差異比較明顯。CK處理的基因多樣性指數最低，HM處理的最高，而LM和ML處理的多樣性指數比較接近，反硝化微生物的多樣性隨肥力程度的提高而逐漸增加。從文庫的均勻度和豐富度來看，與文庫的多樣性指數趨勢一致，說明有機肥量的增加使得反硝化細菌變得更加豐富且使得各類反硝化微生物趨向于更均勻。香農指數與環境因子的相關性分析結果見表4，僅碳氮比與香農指數之間呈顯著正相關，其他各環境因子與香農指數之間無顯著相關關系。

表1 4個nirK克隆文庫酶切分型

表2 4個nirK基因文庫之間的群落相似性矩陣

2.3 系統進化樹的構建與系統發育分析

本文將測序的54個OTUs通過NCBI的BLAST比對去除了3個假陽性結果，得到51個正確的基因序列，在Genbank上選擇了部分與測定序列較為接近的序列，通過BioEdit 和Mega軟件用這些序列構建系統進化樹(圖2)，進行系統發育分析。結果表明，測序的基因彼此之間的相似性在60%~100%，與已知序列進行同源性比較，沒有達到100% 的，說明這些序列可能是之前未被描述過的基因序列；這些OTUs主要被分為3個簇，大部分的OTUs出現在cluster 1中，占總克隆數的78.4%，HM處理在cluster1中占15%，其他3個處理各占25% ~ 30%，同時還發現在cluster 2和cluster 3中均未出現CK樣品中的克隆子，其他3個處理各占30% 左右；紅壤中反硝化細菌具有高度多樣性，51個OTUs分屬于蒼白桿菌屬(sp.)和未培養的細菌，并且絕大多數與未培養細菌的相似度更高。

表3 4個nirK基因文庫的群落結構多樣性指數

表4 香農指數與環境變量的Pearson相關性

注：*表示在<0.05 水平(雙側)顯著相關，=4。

3 討論

反硝化過程是由微生物將環境中被固定的氮素重新釋放到大氣中，從而實現自然界生態系統的氮素循環過程，是自然界氮素循環的重要組成部分[29]。研究表明，反硝化作用產生了大量的溫室氣體，如NO和N2O[30]，導致地球生物圈中氮素損失較大，自然環境的補給量遠小于其損失程度，所以全球氮素預算處于極不平衡的狀態[31-33]。紅壤由于其養分匱乏、有機物質含量較低，因此向紅壤中施肥是提高紅壤經濟效益的有效方式[2,5]，但是關于有機肥添加對于紅壤中含有基因的反硝化細菌群落影響的研究較少。本研究以基因作為分子標記，采用PCR-RFLP方法研究了多種有機肥添加處理對于紅壤反硝化群落結構多樣性的影響，結果表明，4個不同處理文庫之間的群落結構組成有較大的差異，兩兩處理之間的相似性在37.50% ~ 45.34%。有研究認為當群落相似性大于60% 時屬于相似性較好的群落[34]，而本試驗中相似值均小于60%，說明這4個基因文庫之間的相似度均較低。在4個基因文庫中優勢類群所占比例依次為CK 51%、LM 33%、ML 32% 和HM 27%，而各文庫中基因類群的數量依次為14種、19種、20種和25種。通過對香農指數和多樣性指數等分析發現，各指數的變化情況相同，均為HM>ML>LM>CK，和圖1中展示的結果相一致。Yang等[35]研究發現，氮含量較高的土壤有助于增加含有亞硝酸鹽還原酶基因的反硝化菌的豐度；Chen等[36]研究發現，有機物質的添加可以增加反硝化菌群的豐度，并認為有機質的添加和碳含量的增加對于土壤中微生物的生存和繁衍具有積極影響。有機物質的添加可以提供豐富和平衡的營養物質(如高有機碳和一些無機鹽)，有利于氮循環中涉及的微生物的生長，本研究結果的趨勢與之相同。

反硝化細菌群落香農指數與環境因子的Pearson相關性分析結果顯示，僅碳氮比與香農指數呈顯著正相關，其他環境因子與香農指數相關性不顯著，與Yang等[37]的研究結果不符。而鄧玉峰等[38]研究發現石灰的施加會降低細菌的數量，這可能導致了ML處理中反硝化細菌類群數量的減少，但ML處理各環境因子的值仍然較高，因此可能導致相關性檢驗不顯著。

從本研究系統發育樹可以看出，不同的有機肥添加處理土壤中反硝化細菌群落結構主要由-變形菌綱的蒼白桿菌屬(sp)和未培養的細菌組成，其中與未培養細菌相關的片段占到總數的88.2% 以上，與李剛等[39]的研究結果一致，但本研究中未培養細菌相關的比例更高，說明紅壤中出現了豐富的反硝化細菌，這可能與紅壤的性質有關系。紅壤地區降水量豐富，雨季土壤常處于淹水的環境，干旱季節土壤又極易板結、不透氣，時常處于厭氧的環境，有利于滋生反硝化微生物，導致反硝化作用的進行，反硝化基因也表現出豐富的程度[10]。大量研究發現，不同環境下反硝化細菌許多都屬于未培養細菌。Henry等[40]對56個基因序列系統分析，發現多數基因序列與目前已知的可培養反硝化微生物的基因序列不同，Yoshida等[41]研究水稻土中含有基因的反硝化細菌群落，發現大部分細菌都與未培養細菌相關。本研究系統發育樹分析將同屬于蒼白桿菌屬的兩個種聚成兩類，這可能是因為這兩個種中基因的分類較遠。有研究者對和16S rRNA基因的系統發育分析結果表明，基因與16S rRNA基因不一致[42-43]。與蒼白桿菌屬聚類較近的多為CK處理中的克隆子，然后依次為LM、ML和HM處理，這說明不同的施肥條件改變了反硝化細菌的組成，但是具體的相關關系仍需要更為先進的分子生物學技術進行研究。

4 結論

通過向紅壤中添加有機肥可以增加含基因的反硝化細菌多樣性，并且反硝化細菌的類群是隨著有機肥的添加量增加而增加，但是向添加有機肥的處理中添加石灰可以降低反硝化細菌類群數量；相似性分析和系統發育樹表明，有機肥的添加改變了紅壤中反硝化細菌的群落組成，但是并未改變反硝化細菌的優勢菌群類型，未培養細菌是紅壤中反硝化細菌的主要組成部分。

[1] 黃國勤, 趙其國. 紅壤生態學[J]. 生態學報, 2014, 34(18): 5173–5181.

[2] Liu J, Liu M, Wu M, et al. Soil pH rather than nutrients drive changes in microbial community following long-term fertilization in acidic Ultisols of Southern China[J]. Journal of Soils and Sediments, 2018, 18(5): 1853–1864.

[3] Baligar V C, Fageria N K, Eswaran H, et al. Nature and properties of red soils of the world[M]//The Red Soils of China. Dordrecht: Springer Netherlands, 2004: 7–27.

[4] 柳開樓, 黃晶, 張會民, 等. 長期施肥對紅壤旱地團聚體特性及不同組分鉀素分配的影響[J]. 土壤學報, 2018, 55(2): 443–454.

[5] Zebarth B J, Neilsen G H, Hogue E, et al. Influence of organic waste amendments on selected soil physical and chemical properties[J]. Canadian Journal of Soil Science, 1999, 79(3): 501–504.

[6] Franzluebbers A J. Water infiltration and soil structure related to organic matter and its stratification with depth[J]. Soil and Tillage Research, 2002, 66(2): 197–205.

[7] 康國棟, 魏家星, 鄔夢成, 等. 有機物料施用對旱地紅壤作物產量和有機質活性組分的影響[J]. 土壤, 2017, 49(6): 1084–1091.

[8] Celik I, Ortas I, Kilic S. Effects of compost, mycorrhiza, manure and fertilizer on some physical properties of a Chromoxerert soil[J]. Soil and Tillage Research, 2004, 78(1):59–67.

[9] 韓天富, 王伯仁, 張會民, 等. 長期施肥及石灰后效對不同生育期玉米根際鉀素的影響[J]. 土壤學報, 2017, 54(6): 1497–1507.

[10] 滕齊輝. 有機肥施用對紅壤氮素循環微生物相關基因多樣性的影響[D]. 南京: 南京農業大學, 2008.

[11] Cruz A F, Hamel C, Hanson K, et al. Thirty-seven years of soil nitrogen and phosphorus fertility management shapes the structure and function of the soil microbial community in a Brown Chernozem[J]. Plant and Soil, 2009, 315(1/2): 173–184.

[12] Dambreville C, Hallet S, Nguyen C, et al. Structure and activity of the denitrifying community in a maize- cropped field fertilized with composted pig manure or ammonium nitrate[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2006, 56(1): 119–131.

[13] Enwall K, Philippot L, Hallin S. Activity and composition of the denitrifying bacterial community respond differently to long-term fertilization[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(12): 8335– 8343.

[14] Wolsing M, Priemé A. Observation of high seasonal variation in community structure of denitrifying bacteria in arable soil receiving artificial fertilizer and cattle manure by determining T-RFLP of nir gene frag-ments[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2004, 48(2): 261–271.

[15] Zumft W G. Cell biology and molecular basis of denitrification[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR, 1997, 61(4): 533–616.

[16] 康鵬亮, 張海涵, 黃廷林, 等. 湖庫沉積物好氧反硝化菌群脫氮特性及種群結構[J]. 環境科學, 2018, 39(5): 2431–2437.

[17] Braker G, Zhou J Z, Wu L Y, et al. Nitrite reductase genes (and) as functional markers to investigate diversity of denitrifying bacteria in Pacific northwest marine sediment communities[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(5): 2096– 2104.

[18] Sun Y L, Li A, Zhang X N, et al. Regulation of dissolved oxygen from accumulated nitrite during the heterotrophic nitrification and aerobic denitrification of Pseudomonas stutzeri T13[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(7): 3243–3248.

[19] Smith J M, Ogram A. Genetic and functional variation in denitrifier populations along a short-term restoration chronosequence[J]. Applied and Environmental Micro-biology, 2008, 74(18): 5615–5620.

[20] Han B, Ye X H, Li W, et al. The effects of different irrigation regimes on nitrous oxide emissions and influencing factors in greenhouse tomato fields[J]. Journal of Soils and Sediments, 2017, 17(10): 2457– 2468.

[21] Fillery I R P. Biological denitrification[M]//Gaseous Loss of Nitrogen from Plant-Soil Systems. Dordrecht: Springer Netherlands, 1983: 33–64.

[22] Hofstra N, Bouwman A F. Denitrification in agricultural soils: summarizing published data and estimating global annual rates[J]. Nutrient Cycling in Agroecosystems, 2005, 72(3): 267–278.

[23] 王書偉, 顏曉元, 單軍, 等. 利用膜進樣質譜法測定不同氮肥用量下反硝化氮素損失[J]. 土壤, 2018, 50(4): 664–673.

[24] Chen Z, Luo X Q, Hu R G, et al. Impact of long-term fertilization on the composition of denitrifier communities based on nitrite reductase analyses in a paddy soil[J]. Microbial Ecology, 2010, 60(4): 850–861.

[25] Teng Q H, Sun B, Fu X R, et al. Analysis ofgene diversity in red soil amended with manure in Jiangxi, South China[J]. Journal of Microbiology (Seoul, Korea), 2009, 47(2): 135–141.

[26] 汪峰, 曲浩麗, 丁玉芳, 等. 三種農田土壤中氨氧化細菌基因多樣性比較分析[J]. 土壤學報, 2012, 49(2): 347–353.

[27] Zhou J, Bruns M A, Tiedje J M. DNA recovery from soils of diverse composition[J]. Applied and Environ-mental Microbiology, 1996, 62(2): 316–322.

[28] Braker G, Fesefeldt A, Witzel K P. Development of PCR primer systems for amplification of nitrite reductase genes (and) to detect denitrifying bacteria in environmental samples[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(10): 3769–3775.

[29] 孫建光, 高俊蓮, 馬曉彤, 等. 反硝化微生物分子生態學技術及相關研究進展[J]. 中國土壤與肥料, 2007(2): 7–12.

[30] Shoun H, Tanimoto T. Denitrification by the fungus Fusarium oxysporum and involvement of cytochrome P-450 in the respiratory nitrite reduction[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1991, 266(17): 11078–11082.

[31] Ganeshram R S, Pedersen T F, Calvert S E, et al. Large changes in oceanic nutrient inventories from glacial to interglacial periods[J]. Nature, 1995, 376(6543): 755.

[32] Altabet M A, Curry W B. Testing models of past ocean chemistry using foraminifera15N/14N[J]. Global Biogeochemical Cycles, 1989, 3(2): 107–119.

[33] Middelburg J J, Soetaert K, Herman P M J, et al. Denitrification in marine sediments: a model study[J]. Global Biogeochemical Cycles, 1996, 10(4): 661–673.

[34] 王奇贊, 徐秋芳, 姜培坤, 等. 天目山毛竹入侵闊葉林后土壤細菌群落16S rDNA V3區片段PCR的DGGE分析[J]. 土壤學報, 2009, 46(4): 662–669.

[35] Yang C, Hamel C, Gan Y T. Incongruous variation of denitrifying bacterial communities as soil N level rises in Canadian canola fields[J]. Applied Soil Ecology, 2015, 89: 93–101.

[36] Chen Z, Hou H J, Zheng Y, et al. Influence of fertilisation regimes on a nosZ-containing denitrifying community in a rice paddy soil[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2012, 92(5): 1064– 1072.

[37] Yang Y D, Zhao J, Jiang Y, et al. Response of bacteria harboring nirS and nirK genes to different N fertilization rates in an alkaline northern Chinese soil[J]. European Journal of Soil Biology, 2017, 82: 1–9.

[38] 鄧玉峰, 田善義, 成艷紅, 等. 模擬氮沉降下施石灰對休耕紅壤優勢植物根際土壤微生物群落的影響[J]. 土壤學報, 2019, 56(6): 1449–1458.

[39] 李剛, 修偉明, 王杰, 等. 不同植被恢復模式下呼倫貝爾沙地土壤反硝化細菌基因組成結構和多樣性研究[J]. 草業學報, 2015, 24(1): 115–123.

[40] Henry S, Baudoin E, López-Gutiérrez J C, et al. Quantification of denitrifying bacteria in soils bygene targeted real-time PCR[J]. Journal of Micro-biological Methods, 2004, 59(3): 327–335.

[41] Yoshida M, Ishii S, Otsuka S, et al. Temporal shifts in diversity and quantity ofandin a rice paddy field soil[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2009, 41(10): 2044–2051.

[42] Jones C M, Stres B, Rosenquist M, et al. Phylogenetic analysis of nitrite, nitric oxide, and nitrous oxide respiratory enzymes reveal a complex evolutionary history for denitrification[J]. Molecular Biology and Evolution, 2008, 25(9): 1955–1966.

[43] Heylen K, Gevers D, Vanparys B, et al. The incidence ofandand their genetic heterogeneity in cultivated denitrifiers[J]. Environmental Microbiology, 2006, 8(11): 2012–2021.

Effect of Organic Manure Application on Diversity ofGene in Denitrifying Bacteria in Red Soil

ZHANG Chenyang, TENG Qihui, CAO Ying, CUI Zhongli, LI Shunpeng, CAO Hui*

(Key Laboratory of Agricultural Environmental Microbiology, Ministry of Agriculture, College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to understand the effect of organic manure application on the structure of denitrifying bacteria in red soil, four treatments were designed and compared: 1) CK, no manure; 2) LM, low organic manure; 3) ML, high organic manure + lime; and 4) HM, high amount organic manure. The diversity of thegene was estimated by terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) and DNA sequencing of the cloned library. The results showed thatthe 288 clones selected in each treatment can be divided into 78 clusters, and the dominant groups in eachlibrary were of the same cluster, accounting for 51% of the CK, while the other three treatments were 33%, 32% and 27%, respectively. The similarity between the four libraries was between 37.50% and 45.34%. The phylogenetic tree analysis of the 51 OTUs showed that 6 OTUs had the highest similarity withsp., accounting for 11.8% of the total number of sequencing. The remaining 45 OTUs belonged to the uncultured cluster, accounting for 88.2% of the total number of sequencing. Organic manure addition increased the diversity of thegene, but some types of denitrifying bacteria didn’t appear in the original red soil environment.

Denitrifying bacteria;gene; RFLP; Red soil; Application of organic manure

Q938.1

A

10.13758/j.cnki.tr.2021.01.010

張晨陽, 滕齊輝, 曹瀅, 等. 有機肥施加對紅壤中反硝化細菌基因多樣性影響. 土壤, 2021, 53(1): 72–79.

國家自然科學基金項目(41371262；40871125)資助。

(hcao@njau.edu.cn)

張晨陽(1994—)，男，山西長治人，碩士研究生，研究方向為土壤微生物生態學。E-mail: 1044112375@qq.com