共載TPE衍生物和納米銀的PLGA復合載藥體系的抑菌活性研究

匡 昭，張偉偉，項駟文

(安徽工程大學 生物與食品工程學院，安徽 蕪湖 241000)

感染性疾病是致死率最高的病癥之一。抗菌藥物的廣泛使用和濫用已經導致細菌多藥耐藥性的出現。耐藥性細菌感染則需要使用高劑量的抗生素，但這會導致更高的藥物毒性，更長的住院時間和更高的死亡率。耐藥性細菌的全球影響更難以量化，因此，尋找一種安全、高效且不會出現耐藥性細菌的治療方法受到了科研人員的廣泛關注。

如今納米技術在諸如醫學、生物學等大多數研究領域中起著重要的作用，在生物制藥應用中具有潛力。納米材料已開始越來越多地用于生物醫學應用，納米醫學也成為了治療多種疾病的有力工具。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是遞送系統(例如微球)的首選材料，在過去的幾十年中，包含乳酸和乙醇酸的聚合物及其共聚物作為藥物和組織工程中的預期藥物遞送載體而引起了人們的關注。PLGA由于分子結構、形態、機械性質和藥物載體而具有出色的生物降解性和生物相容性，所以它是封裝抗菌化合物的合適選擇。

近年來，無機和金屬配合化學治療領域成為研究熱點，過渡金屬離子螯合的有機雜環配體是潛在的藥物開發領域。1,10-菲啰啉是研究的N，N'-雜環螯合配體之一，相關報道了基于1,10-菲啰啉化合物的抑菌活性。Raman等合成了一系列具有通式[M(L)(phen)] Cl的配合物，其表現出廣譜的抑菌活性和抗真菌活性。1,10-菲啰啉-5,6-二酮衍生物(TPE)顯示出對革蘭氏陰性細菌的高抗菌活性。基于1,10-菲啰啉-5,6-二酮的化合物具有良好的抗菌活性，因此具有開發用于預防和治療由耐藥性細菌引起的感染的新的化學治療手段前景。銀及其化合物具有很強的抑菌殺菌作用，對真菌和病毒具有廣譜抗菌活性。納米銀(Ag NPs)與細菌的特異性相互作用、隨后的滲透以及局部釋放的Ag離子均可導致細菌死亡。因此，Ag NPs因其有效的殺菌作用而受到人們的廣泛關注。

研究通過復乳法合成復合納米載藥體系PLGA@TPE@Ag，通過表征手段對其形貌和特性進行研究，再進一步探究該復合納米載藥體系對耐藥性細菌的抑制活性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PLGA(50∶50，Mw：7 000～17 000 kDa)、聚乙烯醇(PVA，MW：30 000～70 000 kDa；水解度87%～89%)、二氯甲烷、AgNO粉末(99.99%)、NaBH(≥96%)和NaOH購自Sigma-Aldrich Chemical(美國)。所有試驗用水均為蒸餾水。TPE衍生物為實驗室合成。

1.2 Ag NPs合成

十一巰基烷酸和AgNO(0.017 g)等摩爾混合，劇烈攪拌5 min。預配置的NaBH(0.004 56 g)溶液在同一室溫條件下迅速加入到上述溶液中，劇烈攪拌1 h。在磁力攪拌器上繼續攪拌6 h，最后10 000 rpm離心收集產物。

1.3 PLGA載藥納米體系合成

PLGA(500 mg)溶解于2 mL的二氯甲烷中，渦旋5 min后，形成一種乳化液。再次將1 mL的TPE衍生物(四氫呋喃溶液)加入到上述溶液中，繼續渦旋15 min。將5 mL PVA(5%)溶液加入到上述溶液中，探頭式超聲3 min，形成W1/O溶液。超聲結束后，加入25 mL PVA(0.3%)溶液，形成W1/O/W2型溶液。然后磁力攪拌過夜，離心除去有機溶劑，次日收集納米粒子(5 000 rpm，5 min),合成的納米粒子為PLGA-TPE。如果將TPE衍生物替換成Ag NPs粒子，合成的納米粒子為PLGA-Ag。如果將TPE衍生物和Ag NPs同時加入，合成的納米粒子為PLGA@TPE@Ag。

1.4 表征試驗

紫外-可見光譜(UV-vis，S-3100，Scinco Co.，Korea)檢測UV-可見吸收光譜。透射電子顯微鏡(TEM，HT7700，Tokyo Japan，Hitachi)觀察Ag NPs和PLGA@TPE@Ag的形態。掃描電鏡(S-4800,Hitachi,Japan)觀察合成的PLGA形態。動態光散射(DLS)測量PLGA和PLGA@TPE@Ag粒徑分布情況。

1.5 載藥量和包封率試驗

稱取一定質量干燥的各種PLGA納米體系(PLGA-TPE、PLGA-Ag和PLGA@TPE@Ag)，溶解在1 mL的二氯甲烷溶液中，渦旋震蕩10 min溶解后，再加入1 mL PBS溶液，繼續渦旋震蕩10 min，吸取一定體積的上清液進行不同波長的紫外檢測，目的是檢測TPE和Ag NPs吸光度。然后根據已建立的藥物標準曲線，計算溶液中藥物的含量。PLGA@TPE@Ag載藥體系是將二者的藥物的總量計算在內。

包封率=溶液中藥物質量/總的投藥量,載藥量=溶液中藥物質量/干燥載藥體系質量。

1.6 藥物緩釋試驗

探究PLGA載藥納米體系(PLGA-TPE、PLGA-Ag和PLGA@TPE@Ag)的體外緩釋特性試驗方法如下：將適量的單個PLGA載藥納米體系溶解在PBS緩沖液中，然后將溶液轉移至已預處理的透析袋中(MWCO=10 kDa)，透析袋置于合適的裝有PBS緩沖溶液的燒杯中。然后分別在不同的時間點檢測溶液的吸光度，計算材料累積的濃度百分比。

1.7 細菌培養

常見的革蘭氏菌(大腸桿菌ATCC 8739，金黃色葡萄球菌ATCC 6538和枯草芽孢桿菌ATCC 6633)從安徽農業大學生命科學學院獲得，在37 ℃條件下活化培養24 h。將單菌落重新接種至液體培養基，繼續在37 ℃、200 rpm搖床條件下培養12 h。最后,將此轉接的細菌混懸液按照1∶40的比例置于新鮮的LB液體培養基中，在37 ℃、200 rpm搖床條件下培養2～3 h，當測得OD=0.5時可知，此時細菌處于對數生長期。

1.8 抑菌活性試驗

對數期的細菌細胞的溶液(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌)經過合適濃度稀釋后，分別在含有空白PLGA、TPE、Ag NPs、PLGA-Ag、PLGA-TPE和PLGA@TPE@Ag的溶液中孵育1 h。然后涂布于LB-瓊脂平板，PLGA、TPE、Ag NPs、PLGA-Ag、PLGA-TPE作為對照組，無任何處理的細胞作為空白組。通過計數菌落形成單位(CFU)來統計存活細胞數量。

不同材料溶液(PLGA、TPE、Ag NPs、PLGA-Ag、PLGA-TPE、PLGA@TPE@Ag、氨芐青霉素和卡那霉素溶液)的最小抑制濃度(MIC)是利用液體渾濁度培養法進行評估測定的。簡言之，將對數期的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接種在含有不同材料梯度稀釋液的液體LB培養基里，并在37 ℃、200 rpm培養12 h。之后將每組藥物對應的試管進行渾濁度對比。MIC值被定義為可以抑制細菌的最低藥物濃度。每種材料溶液對應的兩種細菌分別進行3次重復試驗，MIC最終值取3次平均值。

1.9 LIVE-DEAD試驗

對數期耐藥性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌與PLGA@TPE@Ag(20 μg/mL)共同孵育1 h后，繼續在37 ℃、200 rpm培養12 h。同樣濃度的TPE、Ag NPs、PLGA-TPE和PLGA-Ag處理的細胞作為對照組，不作任何處理的細胞作為空白組。培養結束后，收集細菌細胞并使用PBS(0.1 M)洗去培養基兩次。使用LIVE/DEAD細菌試劑盒(SYTO9和碘化丙啶(PI)，Life Technologies)在黑暗中染色細菌30 min，染色結束后繼續使用PBS(0.1 M)洗滌細胞兩次，目的是除去多余的染色液。吸取5 μL稀釋至合適濃度的細胞懸浮液滴在載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察染色后的細胞。

1.10 超薄切片試驗

對數期耐藥性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌與PLGA@TPE@Ag(20 μg/mL)共同孵育1 h后，繼續在37 ℃下，200 rpm培養12 h。同樣濃度的TPE、Ag NPs、PLGA-TPE和PLGA-Ag處理的細胞作為對照組，不作任何處理的細胞作為空白組。培養結束后，收集細菌細胞(3 000 rmp，5 min)并用PBS(0.1 M)洗滌兩次。然后用2.5%戊二醛溶液(w/v)和2%多聚甲醛(w/v)4 ℃過夜固定，次日同樣使用PBS(0.1 M)洗滌細胞兩次。最后通過透射電鏡觀察復合載藥體系作用細胞后的細胞內部形態的變化。

1.11 毒性試驗

對PLGA@TPE@Ag的生物毒性進行評估，主要是通過探究小鼠重要器官(心、肝、脾、肺和腎)受到的損傷情況來斷定。主要的檢測手段是對器官切片進行HE染色，觀察組織損傷情況。將小鼠分為兩組試驗，第一組為空白組，僅僅使用PBS處理小鼠；第二組為PLGA@TPE@Ag，注射劑量為2 mg/kg，連續30天對小鼠進行注射。30天后安樂死處死小鼠，收集所有組小鼠的重要器官并進行HE染色。

2 結果與分析

2.1 表征

合成了一種共載TPE衍生物及納米銀的PLGA復合載藥體系，該納米載藥體系的表征結果如圖1所示。首先對Ag NPs、PLGA、PLGA-TPE和PLGA@TPE@Ag的紫外分光光譜圖進行檢測分析，結果如圖1a所示。由圖1a可知，PLGA-TPE相對于空白的PLGA，其特征峰有明顯的紅移，紅移大約為10 nm左右，此結果說明PLGA包裹TPE是成功的。同時再比較Ag NPs和PLGA@TPE@Ag的特征峰的位置，明顯發現Ag NPs被包裹進PLGA載藥體系內后，其特征峰發生90 nm的位移。圖1a結果可作為PLGA@TPE@Ag成功合成的主要判定方法之一。PLGA載藥后的粒徑的分布情況結果如圖1b所示。 由圖1b可知，空白的PLGA和PLGA@TPE@Ag的平均粒徑的大小是類似的，大約在300 nm左右，從分布情況來說，PLGA@TPE@Ag更加集中。載藥體系形態是通過電鏡直接觀察得到，結果如圖1d和圖1e所示。圖1d是空白的PLGA NPs，可觀察到形態大小幾乎一致，分散均一，形態呈現圓形結構，表面光滑；圖1e是PLGA@TPE@Ag的透射電鏡圖像，結果可發現大小和空白的PLGA幾乎一致，且形態方面也類似，可明顯觀察到PLGA@TPE@Ag內部顏色較深的核心區域。此結果的出現間接證明了其包裹的原子序數較高的Ag和TPE中的元素存在。同時我們也通過透射電鏡觀察了Ag NPs的形態，其大小在5 nm左右(見圖1c)。綜上所述，表征的相關試驗證明了共載TPE衍生物及Ag NPs的PLGA復合載藥體系成功合成，其粒徑大小在300 nm左右，分散均一，形態呈現光滑的圓形結構。

圖1 PLGA@TPE@Ag的表征試驗結果

2.2 PLGA復合載藥體系藥物緩釋研究

PLGA包裹的小分子藥物具有藥物緩釋的特性，藥物緩釋可將包裹的藥物以適當的濃度持續地釋放出來，使治療效果達到最大值，不會對機體產生大的毒性損傷，結果如圖2所示。研究了Ag NPs和TPE兩種藥物的緩釋，結果可以看出未包裹的Ag NPs在20 h內，其釋放達到80%左右，說明單純的Ag NPs沒有藥物緩釋特性。而PLGA包裹后的Ag NPs，其藥物釋放明顯減緩，前24 h藥物釋放僅僅達到32%，且后期三天的內釋放也是緩慢的，符合藥物緩釋特性。同樣的釋放曲線出現在PLGA@TPE@Ag載藥體系中，其釋放的Ag NPs比例相對于PLGA包裹后的Ag NPs略微下降，但是差別不是很明顯。由圖2a可知，PLGA復合載藥體系具有藥物緩釋特性且可間接判斷PLGA@TPE@Ag包裹Ag NPs含量相對于PLGA-Ag是相差無幾的。TPE的藥物緩釋曲線如圖2b所示。由圖2b可知，結果與Ag NPs緩釋曲線類似，PLGA復合載藥體系具有藥物緩釋特性且可間接判斷PLGA@TPE@Ag包裹TPE含量相對于PLGA-TPE是相差無幾的。說明其PLGA復合載藥體系相對于單載藥體系，其總載藥量是明顯增加的，結果如表1所示。在PLGA納米體系的載藥量和包封率的試驗測試結果中，PLGA@TPE、PLGA@Ag和PLGA@TPE@Ag包封率分別是68±2.8%、62±1.3%和73±0.9%，載藥量分別是18±2.5%、22±1.1%和35±3.7%。共載TPE衍生物及納米銀的PLGA復合載藥體系具有明顯的藥物緩釋特性。通過載藥量和藥物釋放結果也明確了復合載藥體系的載藥量明顯高于單一的載藥量。

圖2 PLGA@TPE@Ag緩慢釋放測試結果

表1 PLGA納米載藥體系的包封率和載藥量

2.3 抑菌活性初步探究

在MIC試驗研究中，結果如表2所示。PLGA@TPE@Ag對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌MIC值分別是2.3±0.09 μg/mL、1.9±0.04 μg/mL和1.2±0.05 μg/mL。卡那霉素抑制三種細菌的MIC值分別為0.8±0.03 μg/mL、0.2±0.01 μg/mL和0.5±0.01 μg/mL，氨芐青霉素抑制三種細菌的MIC值分別為12.3±0.17 μg/mL、3.9±0.08 μg/mL和0.3±0.03 μg/mL。此結果說明PLGA復合載藥體系對細菌具有高效的抑制活性，且具有一定的廣譜抑菌效果。單純的TPE對三種細菌的抑制活性較低，這和其極低的水溶性的關聯是分不開的。空白的PLGA是不會對細菌產生任何抑制活性的，因此可排除該材料的抑菌活性影響。PLGA@TPE@Ag的抑菌活性優于單一的載藥體系(PLGA-TPE和PLGA-Ag)，此現象也說明了復合載藥體系的優越性。

CFU試驗結果如圖3所示。圖3a中是PLGA@TPE@Ag對大腸桿菌的CFU試驗結果，由圖3a可知，PLGA@TPE@Ag質量濃度在20 μg/mL時對大腸桿菌的菌落生成的抑制率達到98%以上，而單純的相同濃度的TPE僅僅為72%，Ag NPs為38%；單一載藥的PLGA-TPE和PLGA-Ag也具有一定的抑制率，效果分別是28%和26%。此結果說明了單一載藥體系的納米材料對大腸桿菌的抑菌活性低于復合載藥體系，單一載藥的PLGA-TPE和PLGA-Ag有類似的抑菌效果，間接說明水溶性被逆轉的TPE本身也具有較強的抑菌活性。類似的結果也出現在圖3b中，在抑菌試驗的初步研究中可得知PLGA@TPE@Ag展現較強的抑菌活性，相對于單一的載藥體系，說明PLGA復合載藥體系是成功的。

表2 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑制濃度數值

圖3 PLGA@TPE@Ag抑菌活性試驗結果注：沒有任何處理的兩種細菌細胞的CFU為空白組、PLGA、TPE、Ag NPs、PLGA@TPE和 PLGA@Ag為對照組(20 μg/mL)。

2.4 細胞凋亡率測定

利用熒光染料對藥物處理的細胞進行染色，活細胞可被SYTO9染色成綠色熒光細胞，死細胞可被PI染色成紅色熒光細胞，通過共定位處理后可直觀地觀察到細胞死亡比例。PLGA@TPE@Ag(20 μg/mL)處理后耐藥性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞的熒光共聚焦成像圖分別如圖4a與圖4b所示。同樣濃度的TPE、Ag NPs、PLGA-TPE和PLGA-Ag作用的細胞的染色結果作為對照組，細胞不經過任何處理的作為空白組。由圖4可知，TPE組含有少量的紅色熒光細胞，說明其導致了部分細胞的凋亡。相對于TPE組，Ag NPs、PLGA-TPE和PLGA-Ag三組中出現的紅色熒光細胞明顯增多，說明三者的抑菌活性是增強的，PLGA-TPE組抑菌活性的增強說明PLGA包裹TPE后，提高了TPE的抑菌活性。Ag NPs和PLGA-Ag類似的抑菌活性，說明PLGA包裹Ag NPs后形成的單一載藥體系對該納米粒子抑菌活性的提高是不明顯的。通過觀察復合載藥體系PLGA@TPE@Ag作用細菌后的熒光共定位圖像可得知，大部分的細菌均被染色成紅色熒光，說明細胞已經凋亡。復合載藥體系PLGA@TPE@Ag對耐藥性的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制率可達95%以上，該復合載藥體系的抑菌活性得到進一步地肯定。

圖4 PLGA@TPE@Ag熒光共聚焦成像圖注：TPE、Ag NPs、PLGA@TPE和PLGA@Ag為對照組(20 μg/mL)。SYTO 9(綠色熒光)和PI(紅色熒光)染色細胞(30 min)。細胞不經過任何處理的作為空白組。

2.5 細胞內部形態的研究

在進行了超薄切片試驗，觀察復合載藥體系作用細胞后其內部形態的變化，結果如圖5所示。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的空白組細胞保持完整的內部細胞形態，胞內的細胞核和其他細胞器是清晰存在的。TPE組少部分的細胞區域出現破損，細胞基本保持完整性，說明TPE對細胞具有一定的破壞。但是在Ag NPs、PLGA-TPE和PLGA-Ag組中細胞開始出現大面積的破損，胞內物質出現，細胞出現部分空洞情況。此結果說明了三者具有一定的抑制活性。復合載藥體系PLGA@TPE@Ag組中，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞破損的區域非常大，幾乎可觀察到大部分細胞出現破損情況，內含物流出，無完整的細胞形態，細胞變得非常空洞。復合載藥體系PLGA@TPE@Ag相對于單一載藥體系(PLGA-TPE和PLGA-Ag)，其抑菌活性又得到較大的提高，說明相同濃度下復合載藥體系的抑菌活性更強。復合載藥體系PLGA@TPE@Ag可破壞細胞的內部形態，這也有可能是導致其細菌被抑制存活的主要機制。

圖5 PLGA@TPE@Ag超薄切片試驗結果注：TPE、Ag NPs、PLGA-TPE和 PLGA-Ag(20 μg/mL)作用的細胞被設置成對照組，無任何處理的細胞設置成空白組。

2.6 毒性分析

復合載藥體系PLGA@TPE@Ag在體內體外均展現較強的抑菌活性，是一種潛在的納米級的藥物。但是作為潛在的納米級藥物，其生物毒性是必須要考慮的主要因素。因此通過免疫組化，將PLGA@TPE@Ag連續注射正常小鼠30天，觀察小鼠器官組織學變化，從而來判定該納米體系藥物會不會對小鼠造成很大的損傷，結果如圖6所示。通過與空白組對比，主要器官的HE染色結果是完全類似的，全部展現較好的生理學特征，無任何的細胞凋亡、組織水腫、組織損傷情況。此結果說明該復合載藥體系PLGA@TPE@Ag對小鼠是無任何毒性的，可作為一種潛在的納米級的抗菌藥物。

圖6 小鼠HE組織染色評估PLGA@TPE@Ag毒性結果注：使用1 mL PBS(0.1 M)處理的小鼠設置為空白組，使用2 mg/kg 劑量的PLGA@TPE@Ag處理小鼠設置為處理組。

3 小結

研究成功合成了復合納米載藥體系PLGA@TPE@Ag。由共載TPE衍生物及Ag NPs的PLGA復合載藥體系的表征試驗結果可知，其粒徑大小在300 nm左右，分散均一，形態呈現光滑的圓形結構。作為一種包裹型的納米粒子，其載藥量達到了35±3.7%，包封率為73±0.9%。通過相關的藥物緩釋肯定了復合納米載藥體系PLGA@TPE@Ag具有明顯的藥物緩釋特性。通過載藥量和藥物釋放結果也明確了復合載藥體系的載藥量明顯高于單一的載藥量，其抑菌活性相對于單一的載藥體系理論上也會有極大的提高。PLGA@TPE@Ag對耐藥性的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌MIC值分別是2.3±0.09 μg/mL、1.9±0.04 μg/mL和1.2±0.05 μg/mL。PLGA@TPE@Ag濃度在20 μg/mL時對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的菌落生成的抑制率都高達90%以上。通過熒光染色試驗也進一步肯定了復合載藥體系PLGA@TPE@Ag對耐藥性的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制。該合成的載藥體系PLGA@TPE@Ag對形態的破壞是明顯的，這一點也有可能是導致其細菌被抑制存活的主要機制。在毒性試驗探究中，PLGA@TPE@Ag注射的小鼠的主要器官的HE染色結果展現較好的生理學特征，無任何的細胞凋亡、組織水腫和組織損傷情況。