黃土高原雨養區不同種植年限紫花苜蓿土壤細菌群落特征與生態功能預測

馬欣 ，羅珠珠 ，張耀全 ，劉家鶴 ，牛伊寧 ，蔡立群 ，

（1. 甘肅農業大學資源與環境學院，甘肅蘭州730070；2. 甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅蘭州730070；3. 延安市農業科學研究所，陜西延安716000）

西部黃土高原丘陵溝壑區是中國乃至世界上水土流失最嚴重的區域之一，該區以小麥（Triticum aestivum）和玉米（Zea mays）單作為主的傳統農業生產方式和自然資源過度利用是引起水土流失的最主要原因。嚴重的水土流失不僅破壞生態環境，而且降低土壤質量，減少土壤碳氮固存。紫花苜蓿（Medicago sativa）為豆科作物，因其高產、耐瘠、耐寒、保土和適應性強等優良特性，在黃土高原地區廣泛種植，是當地退耕還林的主要草種，其根瘤可在根瘤菌的作用下固定游離氮，地上部枯枝落葉可經微生物分解增加土壤有機碳［1］，改善土壤團粒結構［2］，因此紫花苜蓿對于西北生態脆弱區的生態修復和土壤結構改善有著重要作用。但是苜蓿持續種植多年后會引起土壤水分［3-4］和磷（phosphorus，P）素［5-6］嚴重耗竭，導致牧草產量下降，草地嚴重退化。

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，可通過參與土壤中碳素轉化，影響腐殖質的形成；參與物質循環，聚集土壤，有利于土壤結構和理化性質的穩定［7］。作為生態系統功能的基礎和生態系統健康的指示物，土壤微生物群落結構的多樣性可以反映出生態環境的功能演變及其環境影響［8］。細菌作為土壤微生物中數量最豐富的菌群，參與物質循環和養分吸收等過程［9］，影響著土壤養分的吸收和轉化，且細菌群落結構的變化規律在一定程度上可反映土壤質量現狀，亦可用來表征土壤生態功能［10］。隨著分子生物學技術與方法的不斷發展，關于土壤細菌的研究逐步從結構轉向功能，研究土壤細菌功能對于揭示細菌在土壤生態系統中的作用具有重要意義［11-13］。PICRUSt（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）方法是基于系統發育與功能充分聯系的假設，將現有的應用16S rRNA 測序基因與已知代謝功能的微生物參考基因組數據庫相對比，從而實現對細菌代謝功能的預測，為深入理解微生物功能提供了新途徑［14-15］。目前PICRUSt 算法已應用于土壤、海洋和湖泊細菌功能分析中［16-17］，使得不同的微生物類群能夠解釋不同的生態系統功能，為土壤微生物群落結構與功能研究提供了新途徑。

紫花苜蓿連續種植多年對土壤細菌群落有一定影響。Agnello 等［18］在對評估法國地區苜蓿植被恢復潛力的研究中發現種植苜蓿能夠有效提高根際細菌活性；邰繼承［19］對內蒙古灰色草甸土的研究發現，種植5 年的紫花苜蓿土壤細菌數量高于種植2 年苜蓿地；蔡艷等［20］采用454 測序技術發現，連續種植苜蓿會加速土壤水分和磷素的耗竭，導致其細菌多樣性不及農田豐富。耿德洲等［21］采用高通量測序技術發現，與農田相比，貧營養型細菌類群酸桿菌門豐度在苜蓿土壤中有所增加，而富營養型細菌類群變形菌門則減少，并且隨著種植年限的增加下降程度加劇。紫花苜蓿是豆科固氮植物，持續種植多年后產量就會明顯下降，但土壤碳氮儲量和土壤結構通常會得到改善，兩者之間是否矛盾？大量研究表明，苜蓿持續種植多年引起土壤水分［3-4］和P 素［5-6］嚴重耗竭。因此假設，紫花苜蓿長期種植導致土壤剖面發生干燥化且使土壤P 素虧缺，從而可能影響到土壤細菌群落分布格局，而這些地下生物的演替變化影響到其代謝功能的改變和土壤營養元素的有效性，最終導致苜蓿地上生物量發生變化。本研究以農田為對照，通過基于Illumina MiSeq 平臺的高通量測序技術，研究黃土高原雨養農業區旺盛生長期（L2012）和衰敗期（L2003、L2005）苜蓿地土壤細菌分布格局和演替特征及其與環境因子的關系，并結合PICRUSt 預測土壤微生物生態功能，為西部黃土高原苜蓿人工草地的可持續利用和黃綿土細菌代謝潛力、功能預測提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

本試驗于2018 年在甘肅省定西市安定區李家堡鎮甘肅農業大學旱作農業綜合試驗站（104°44′E，35°28′N）進行，該區屬于典型的黃土高原半干旱雨養農業區，平均海拔約為2000 m，年均太陽輻射592.9 kJ·cm-2，平均日照時數2476.6 h，年均氣溫6.4 ℃，0～10 ℃積溫范圍為2239.1～2933.5 ℃，無霜期為141 d，年均降水量400 mm，年蒸發量1531 mm，干燥度2.53。土壤類型為黃綿土，土壤容重1.19 g·cm-3，pH 值8.36，土壤有機質含量12.01 g·kg-1，全氮含量 0.76 g·kg-1，全磷含量 0.89 g·kg-1。

1.2 試驗設計

試驗以農田（玉米）為對照，2003 年（L2003）、2005 年（L2005）、2012 年（L2012）建植的紫花苜蓿人工草地為研究對象，3 次重復，隨機區組排列。小區面積均為3 m×7 m=21 m2。苜蓿品種為當地傳統品種隴東苜蓿，整個生育期無人為干預，各處理田間管理保持一致，每年刈割兩次（6 和10 月）。苜蓿人工草地在2003、2005 和2012 年建植時施純氮105 kg·hm-2，純P2O5105 kg·hm-2，之后在苜蓿生長期間未進行施肥、灌水。玉米品種為先玉335，2013 年開始種植玉米，持續至今，每年播前人工撒施純N 200 kg·hm-2，純P2O5105 kg·hm-2，生育期不再追肥，收獲后期玉米根系不還田。

1.3 土樣采集

于2018 年苜蓿第一茬盛花期（5 月20 日），用土鉆采用對角線五點法采集耕層土壤（0～30 cm），每個取樣點之間的距離間隔1 m，剔除土樣中的植物根系、落葉、石塊等雜物，將土樣充分混勻后裝入滅菌自封袋，干冰保存，迅速帶回實驗室。將土樣分為3 部分，一部分過2 mm 篩置于-80 ℃冰箱用于細菌群落結構的測定，一部分過2 mm篩置于4 ℃冰箱用于土壤硝態氮測定，其余土樣風干后過1 和0.25 mm 篩，用于全氮、有機碳、全磷、速效磷、速效鉀含量和pH 的測定。

1.4 土壤理化指標測定

土壤理化指標均按照《土壤農化分析》［22］中的方法測定：全氮（total nitrogen，TN）含量采用凱氏定氮法測定，土壤有機碳（soil organic carbon，SOC）含量采用濃硫酸-重鉻酸鉀外加熱法測定，全磷（total phosphorus，TP）含量采用HClO4-H2SO4法測定，速效磷（available phosphorus，AP）含量采用NaHCO3-鉬銻抗比色法測定，速效鉀（available potassium，AK）含量采用CH3COONH4-火焰光度法測定，硝態氮（NO3--N）含量采用 2 mol·L-1KCl浸提，全自動化學間斷分析儀（Smart Chem140，意大利）測定，pH 采用酸度計（PB-10，德國賽多利斯）測定。

1.5 細菌16S rRNA 高通量測序

DNA 提取：土壤微生物群落結構土壤總DNA 采用PowerSoil? DNA 提取試劑盒提取，所提取的DNA 的純度用1.0%瓊脂糖凝膠電泳跑膠，用溴化乙錠染色之后在凝膠成像系統檢測。

PCR 擴增：DNA 提取后，利用目標基因引物 515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和 907R（5′-CCGT?CAATTCMTTTRAGTTT-3′）對細菌 16S rRNA 基因 V4～V5 區進行 PCR 擴增［23-24］，擴增條件為：95 ℃預變性2 min，接著進行 25 個循環，包括 95 ℃變性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 30 s；循環結束后 72 ℃最終延伸 5 min。PCR 采用 TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；PCR 儀：ABI GeneAmp? 9700 型；每個樣本3 個重復，將同一樣本的PCR 產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司，美國）切膠回收PCR 產物，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結果，將PCR 產物用QuantiFluor?-ST 藍色熒光定量系統（Promega 公司，北京）進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。

IlluminaMiseq PE300 測序：對PCR 產物進行定量并均一化混勻，利用聚合DNA 產物構建Miseq 文庫，然后借助高通量測序平臺（IlluminaMiseq PE300）測序，由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.6 PICRUSt 基因功能預測

首先通過PICRUSt 對OTU 豐度表進行標準化［25］，即去除16S marker gene 在物種基因組中的copy 數目的影響；然后通過每個OTU 對應的green gene id，獲得OTU 對應的COG 家族信息和KEGG Orthology（KO）信息；并計算各COG 的豐度和KO 豐度。根據COG 數據庫的信息，可以從eggNOG 數據庫中解析到各個COG 的描述信息，以及其功能信息，從而得到功能豐度譜；根據KEGG 數據庫的信息，可以獲得KO、Pathway、EC 信息，并能根據OTU 豐度計算各功能類別的豐度。

1.7 數據處理

采用SPSS 22.0 和Excel 2010 對土壤理化性質和細菌群落組成數據進行處理，差異顯著性分析利用單因素方差分析（ANOVA）和多重比較法（Duncan）。通過上海美吉公司I-Sanger 云平臺進行相關性熱圖（Heatmap）和PICRUSt 基因功能預測，使用CANOCO 5 軟件對細菌群落進行冗余分析（redundancy analysis，RDA）和主成分分析（principal component analysis，PCA），采用AI 軟件進行圖表修飾。

2 結果與分析

2.1 不同種植年限苜蓿土壤化學性質

由表1 可以看出，與農田相比，不同種植年限苜蓿土壤全氮含量顯著增加（P＜0.05），增幅21.43%～40.48%；全磷、速效磷、硝態氮含量顯著降低（P＜0.05），全磷降低10.47%～16.28%，速效磷降低51.87%～85.31%，硝態氮降低60.67%～75.38%；但土壤有機碳表現為L2003和L2005顯著高于農田（P＜0.05），L2012和農田無顯著差異。研究同時發現，隨著苜蓿種植年限的延長，土壤SOC、TN 含量呈現明顯增加趨勢，土壤全氮和有機碳含量均表現為L2003顯著高于L2012（P＜0.05），增幅達15.69%和22.09%，速效磷含量表現為L2012和L2005顯著高于L2003（P＜0.05），不同種植年限苜蓿土壤全磷含量未表現出明顯差異，速效鉀含量在農田和苜蓿土壤間無明顯差異。pH 值表現為苜蓿土壤顯著高于農田土壤（P＜0.05），增幅為3.25%～5.42%，且不同種植年限苜蓿土壤pH 值亦存在差異，表現為L2005顯著高于L2012（P＜0.05）。

2.2 不同種植年限苜蓿土壤細菌群落結構

本研究所有供試黃綿土樣品共檢測到細菌36 門90 綱192 目375 科715 屬，從門水平的分類來看（圖1），土壤細菌主要來自放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloro?flexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、unclassified_k__norank、厚壁菌門（Fir?micutes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、裝甲菌門（Armatimonadetes），其中放線菌門（20.34%～32.40%）、變形菌門（18.99%～23.14%）、酸桿菌門（12.50%～13.39%）、綠彎菌門（11.41%～12.55%）為黃綿土細菌群落優勢菌群，占總序列的69%以上，農田土壤優勢菌為變形菌門，苜蓿土壤優勢菌為放線菌門。

表1 不同處理土壤化學性質Table 1 Chemical properties of different treatments

圖1 不同處理土壤細菌門水平的相對豐度Fig.1 Phylum groups of soil bacterial community in different treatments

與農田相比，苜蓿土壤放線菌門相對豐度顯著增加（P＜0.05），裝甲菌門相對豐度顯著降低（P＜0.05），且放線菌門隨苜蓿種植年限延長呈降低趨勢，裝甲菌門隨苜蓿種植年限延長而升高；不同種植年限苜蓿土壤放線菌門豐度比農田土壤提高51.16%～59.30%，裝甲菌門豐度比農田土壤降低18.42%～48.80%。變形菌門和綠彎菌門相對豐度表現為農田土壤高于苜蓿土壤，且變形菌門、綠彎菌門相對豐度隨種植年限延長先增加后降低，但處理間并無顯著差異。酸桿菌門相對豐度在農田和苜蓿土壤間均無明顯差異。

在屬分類水平上（表2），種類繁雜、豐度較低的稀有細菌類群（相對豐度＜1%）占總序列的33.88%～39.26%，各個門科下屬分類地位不明確的菌屬占總序列的42.58%～47.89%。已分類的相對豐度較高的屬（相對豐度＞1%）依次為Gaiella屬（1.65%～3.33%）、硝化螺菌屬（Nitrospira，1.52%～2.34%）、假節桿菌屬（Pseudarthrobacter，1.36%～2.61%）、Solirubrobacter屬（1.03%～2.24%）、微枝形桿菌屬（Microvirga，1.45%～1.97%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，1.01%～1.94%）、鏈霉菌屬（Streptomyces，1.11%～1.61%）、芽球菌屬（Blasto?coccus，0.99%～2.08%）、H16（0.78%～1.28%）、類 諾 卡 氏 菌 屬（Nocardioides，0.72%～1.79%）、RB41（0.93%～1.25%）、Pir4_lineage（0.40%～1.32%）和溶桿菌屬（Lysobacter，0.16%～1.06%）。

與農田相比，苜蓿土壤Solirubrobacter屬相對豐度顯著增加（P＜0.05），H16、Pir4_lineage 和溶桿菌屬相對豐度顯著降低（P＜0.05）。不同種植年限苜蓿土壤優勢屬豐度亦存在差異，隨苜蓿種植年限延長，Gaiella屬和硝化螺菌屬相對豐度逐漸降低，假節桿菌屬、芽球菌屬、鏈霉菌屬和類諾卡氏菌屬相對豐度逐漸增加，其中Solirubro?bacter屬相對豐度表現為L2005處理顯著高于L2012處理（P＜0.05）。

2.3 土壤細菌群落結構與理化因子關系

對土壤細菌優勢門與環境因子進行Spearman 相關性分析（圖2），結果表明放線菌門與土壤全磷和硝態氮極顯著負相關（P＜0.01），與有機碳和速效鉀顯著負相關（P＜0.05），與pH 顯著正相關；硝化螺旋菌門與有機碳和全磷極顯著負相關（P＜0.01），與硝態氮和速效鉀呈顯著負相關關系（P＜0.05）；芽單胞菌門與全氮和有機碳極

顯著負相關（P＜0.01）；裝甲菌門與全磷、硝態氮和速效鉀極顯著正相關（P＜0.01），與有機碳顯著正相關（P＜0.05）；酸桿菌門與有機碳極顯著正相關（P＜0.01），與全磷和速效鉀顯著正相關（P＜0.05）；變形菌門、浮霉菌門和擬桿菌門均與有機碳、全磷極顯著正相關（P＜0.01）；變形菌門還與速效鉀極顯著正相關（P＜0.01）。總而言之，有機碳和全磷對細菌群落結構影響明顯。

表2 不同處理細菌優勢屬相對豐度Table 2 Microbial community composition at genus rank in different treatments（%）

圖2 土壤環境因子與細菌門水平相關性熱圖Fig.2 Correlation heatmap between soil environmental factors and phylum of bacterial

為進一步揭示影響苜蓿種植地土壤細菌群落組成的土壤環境因子，以不同種植年限苜蓿土壤細菌屬水平群落豐度為響應變量，土壤TN、NO3--N、SOC、TP、AP、AK 和 pH 為解釋變量進行冗余分析（RDA）（圖 3）。結果表明，Gaiella屬、Solirubrobacter屬、類諾卡氏菌屬、芽球菌屬、假節桿菌屬與土壤全氮呈顯著正相關關系，與全磷、速效磷和硝態氮呈顯著負相關關系；芽球菌屬、假節桿菌屬、微枝形桿菌屬與有機碳和速效鉀顯著正相關；Pir4_lineage、溶桿菌屬與全磷、速效磷和硝態氮顯著正相關，pH 與硝化螺菌屬顯著正相關。其中，土壤全磷（P=0.002）是影響苜蓿土壤細菌群落結構的最主要因素。

圖3 細菌群落與環境因子的RDA 圖Fig. 3 RDA ordination graph for the bacterial community and environmental factors

2.4 不同種植年限苜蓿土壤細菌PICRUSt 功能預測

為了解黃綿土細菌代謝功能，采用PICRUSt 軟件進行功能預測。將預測得到的功能基因家族與KEGG 數據庫比對發現，在一級功能代謝通路農田和苜蓿土壤獲得相對豐度＞1%的所有菌群的基因序列注釋到的功能可分為6 類（圖4）：新陳代謝、環境信息處理、遺傳信息處理、細胞轉化、人類疾病和生物體系統，其中新陳代謝為農田和苜蓿土壤細菌最主要的功能，占比為69.20%～70.22%。與農田相比，苜蓿土壤微生物新陳代謝、生物體系統功能基因豐度顯著提高（P＜0.05）；且隨苜蓿種植年限延長，細胞轉化功能基因、生物體系統功能基因呈增加趨勢。

圖4 不同種植年限土壤細菌功能基因KEGG 豐度圖（一級功能層）Fig. 4 Soil bacterial function prediction in different growth years（hierarchy level 1）

圖5 不同種植年限苜蓿土壤細菌功能多樣性熱圖Fig.5 Heat map of bacterial functional diversity in alfalfa soil under different growth years

二級功能預測發現（圖5），苜蓿土壤和農田土壤均有碳水化合物代謝、全局概覽通路、氨基酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素代謝、膜運輸、翻譯、細胞運動、傳染病：細菌、內分泌系統等46 個子功能，其中碳水化合物代謝（13.68%～13.95%）、全局概覽通路（12.53%～12.63%）和 氨 基 酸 代 謝（11.75%～11.91%）為主要子功能。與農田相比，苜蓿土壤輔助因子和維生素代謝、核苷酸代謝、折疊、分類和降解、傳染病：細菌、免疫系統和信號分子及相互作用功能基因顯著降低（P＜0.05）；碳水化合物代謝、外源物質降解及代謝、萜類和酮類化合物代謝、內分泌系統、神經系統和物質依賴功能基因顯著增加（P＜0.05）。其中碳水化合物代謝、全局概覽通路、氨基酸代謝、脂質代謝和外源物質降解及代謝等功能基因豐度隨種植年限延長逐漸增加，能量代謝、輔助因子和維生素代謝、核苷酸代謝、翻譯、復制和修復等功能基因豐度隨種植年限延長逐漸降低，但不同種植年限苜蓿土壤的功能基因在二級功能層均未表現出明顯差異。主成分分析（PCA）發現（圖6），在PC1 和PC2軸上，農田、旺盛期苜蓿草地和衰敗期苜蓿草地土壤微生物群落功能顯著分開，解釋度達46.94%和36.63%。農田土壤功能基因主要分布在第1、2 象限，衰敗期苜蓿（L2003和L2005）土壤功能基因主要聚集在第3 象限，旺盛期（L2012）苜蓿土壤功能基因主要分布在第4 象限。由此推斷，農田和苜蓿土壤細菌功能組成差異較大，且旺盛期苜蓿和衰敗期苜蓿土壤細菌功能組成也存在一定差異。

3 討論

3.1 種植年限對苜蓿土壤化學性質的影響

圖6 細菌功能多樣性主成分分析Fig.6 Principal component analysis of bacterial functional diversity

苜蓿屬于深根系、高耗水的豆科固氮植物，持續種植多年后導致土壤剖面理化性質發生改變。種植苜蓿可增加土壤有機質和全氮含量，但苜蓿對磷含量耗竭強烈［5-6］。本研究發現，隨著苜蓿種植年限延長，土壤全氮含量呈增加趨勢，這與張春霞等［26］的研究結果一致，這是由于苜蓿為固氮作物，隨著種植年限的增加，其根部受根瘤菌的侵入，刺激根部膨大形成的根瘤-苜蓿根共生關系逐漸穩定，根瘤菌固定到土壤中的氮素含量也隨之增加，此外，隨著苜蓿進入衰退期，生物量逐漸下降，苜蓿本身對氮素的需求量也逐漸下降，進而使得土壤氮素呈上升趨勢［27］。而土壤中氮含量的增加會增強土壤氮的礦化速率，隨著植物氮素對土壤中硝態氮的吸收，土壤氮平衡打破，使得硝化作用加強，進而導致其轉化的硝態氮含量也逐漸提高，最后可能會引起土壤中硝態氮的富集［28］，本研究中苜蓿土壤硝態氮含量的變化趨勢與其相符。本研究還發現，土壤有機碳含量隨著苜蓿種植年限的增加亦增加，這可能是由于隨苜蓿種植年限延長，地上部的枯枝落葉和地下部的植物殘根不斷累積，再通過微生物腐解后形成腐殖質，增加了土壤有機碳含量，加之苜蓿土壤長期未翻耕擾動，促進了有機碳在表層的積累［10］。與土壤碳、氮不同的是，土壤全磷和速效磷含量隨苜蓿種植年限延長而降低，這是因為僅在苜蓿建植當年施入磷肥，之后苜蓿多年生長過程中并添加磷肥，其生長中所需的磷營養只能從土壤中攝取，使得土壤速效磷在不斷供應苜蓿生長過程中嚴重耗竭，且土壤中難溶性的磷也會因轉化消耗而導致土壤全磷水平下降［6，29］。

3.2 種植年限對苜蓿土壤細菌群落結構的影響

土壤細菌群落結構受種植作物的影響［30］，不同植物類型根系分泌物存在異質性，使得土壤微生物所處環境發生改變，細菌組成和豐度大小亦有差異［31］。本研究發現黃綿土農田和苜蓿人工草地土壤細菌群落組成相似，主要有放線菌門、變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、硝化螺旋菌門和裝甲菌門10 類菌群，但是優勢菌群的豐度有所變化。苜蓿土壤放線菌門相對豐度顯著高于農田土壤，且隨種植年限延長呈降低趨勢。放線菌在纖維素、半纖維素降解以及果膠和木質素轉化中起最主要的作用［32］，為土壤提供養分且可以分泌多種抗生素類物質，而人工草地具有更多的抗生素資源［21］；且農田土壤中C、N 營養遠遠低于苜蓿土壤，這可能是制約放線菌繁殖的因素，使其豐度不及苜蓿土壤。纖維素類物質是土壤有機質的重要組成部分，苜蓿屬多年生固氮植物，刈割后凋謝物逐年累積，土壤有機質含量遞增［10］，但隴中黃土高原半干旱區多年平均降水量不足400 mm，遠不能滿足苜蓿生長對水分的需求，苜蓿持續種植10 年以后草地已經處于相當干燥的土壤水分環境［33］，雖然苜蓿地土壤水分受當地降水量影響明顯，但無論干旱還是半干旱區，種植苜蓿超過6～7 年土壤水分均大幅度降低［34］，水分含量降低會影響到根系的生長和活力，從而影響到根系分泌物質的含量，因此會降低根際土壤中放線菌門相對豐度［35］。同時放線菌還具有解磷作用，其相對豐度對于土壤磷含量具有一定的指示作用［36］，隨著苜蓿生長年限的延長，苜蓿自身的生理代謝逐漸減弱、根系生長和活力會有一定程度下降，苜蓿自毒化感作用的增強導致土壤中可利用資源下降［37］，進而對微生物群落結構造成影響。變形細菌能夠利用有機物分解產生的氨氣、甲烷等營養物質進行生長代謝活動［38］。本研究中變形菌門為農田土壤最優勢菌群，這與劉泉成等［39］對玉米細菌群落的研究結論一致，農田土壤變形菌門豐度顯著高于苜蓿土壤可能是由于種植的玉米CH4吸收量、N2O 排放量均高于苜蓿［40］，為變形菌的生長代謝提供適宜的條件。變形菌門相對豐度隨種植年限延長呈增加趨勢，之后隨著苜蓿生長的衰敗又有所降低。長期種植苜蓿后，其枯枝落葉經微生物分解進入土壤，不斷增加土壤有機碳含量，變形菌可利用有機碳為土壤提供固氮能力且對農田土壤養分循環有明顯的促進作用［41-42］，隨苜蓿種植時間延長，其全氮含量與有機碳含量明顯增加，為變形菌的生長代謝提供營養條件，使其豐度不斷增加。此外作為富含蛋白質的豆科牧草，苜蓿根瘤結構可以顯著提高生物量的積累，長期種植苜蓿后根系的生長和生理活性增加，根系分泌物有利于促進土壤微生物的繁衍，使其生命活動旺盛，引起與根際效應直接相關聯的變形菌門相對豐度增加［43］，但之后苜蓿草地開始退化，地上生物量減少，種間競爭增強產生自毒效應損害根系生長，降低根瘤菌的固氮能力［37］，使變形菌門豐度略有降低。擬桿菌門與有機碳和全磷有顯著正相關關系，可能是因為擬桿菌為富營養細菌，能有效利用土壤中C、P 營養［44］，有機碳含量的累積為擬桿菌和酸桿菌的生長繁殖提供了有利條件。

在細菌屬水平，苜蓿土壤Solirubrobacter屬和類諾卡氏菌屬相對豐度顯著高于農田土壤，這與植被類型有關。Solirubrobacter屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和類諾卡氏菌屬等可以通過產生抗生素類物質或植物生長素等的方式對植物病原菌產生拮抗作用［45-46］。苜蓿根系會分泌酚酸類等化感物質，在土壤中逐漸積累［47］，部分促使與病原菌增加產生拮抗作用的益生菌活性增加。Gaiella屬作為不同種植年限苜蓿土壤已分類的最優勢屬（2.56%～3.32%），相對豐度并未出現顯著性差異，可能是因為隸屬于放線菌的Gaiella屬能產生種類繁多的抗生素，使土壤中大量儲存抗生素產生菌資源，尤其是干旱、高溫等逆境條件更有利于Gaiella屬的生長繁殖［48］。長期種植苜蓿土壤硝化螺菌屬含量逐漸降低，與土壤硝態氮含量顯著負相關，可能是因為硝化螺菌屬是典型的亞硝酸鹽氧化菌，具有氨氧化作用，參與土壤中氮素循環，且適宜生存在硝態氮含量較低的地方［49］；螺旋菌參與土壤硝化過程，且隨著苜蓿種植年限的延長，根瘤菌不斷固定大氣中的氮素，土壤中的氮素含量呈現緩慢上升趨勢，更多的氮轉化為更有利于旱地植物吸收的硝態氮，而硝化螺旋菌以NH4+為底物，過高的pH 會降低其豐度［50］。本研究還發現，在屬分類水平上稀有細菌類群占總數量的33.88%～39.26%，說明黃綿土中還存在未被挖掘利用的微生物資源，還須進一步探索。

3.3 種植年限對苜蓿土壤細菌功能基因的影響

PICRUSt 分析通過與KEGG 數據庫比對，將微生物的變化情況和生物功能聯系起來［17］。目前該方法已在不同植物土壤細菌功能研究中得到應用，為細菌的生態功能研究提供了幫助［51-53］。將黃綿土區農田和苜蓿土壤測序結果進行PICRUSt 功能預測分析發現，黃綿土主要有碳水化合物代謝、全局概覽通路、氨基酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素代謝、膜運輸、翻譯、細胞運動、傳染病∶細菌、內分泌系統等46 個功能基因，充分證明其功能豐富性。新陳代謝（69.20%～70.22%）通過攝取碳水化合物、氨基酸、能量和維生素等來保證細菌的存活成為細菌群落最主要的功能，這也印證相關研究的結論［52-53］。本研究中苜蓿土壤代謝功能顯著高于農田土壤，主要體現在碳水化合物代謝、外源物質降解及代謝、萜類和聚酮類化合物代謝方面，這與土壤益生菌含量有一定關系，土壤微生物通過代謝活動促進植物生長、提高作物產量，而苜蓿土壤Solirubrobacter屬和類諾卡氏菌屬相對豐度顯著高于農田，Solirubrobacter屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和類諾卡氏菌屬等可以通過代謝產生抗生素類物質或植物生長素等方式對植物病原菌產生拮抗作用，促進植物生長［45-46，54］。苜蓿屬為多年生草本，其根瘤菌的固氮作用較強，隨種植時間的延長積累在地表的殘留物增多，凋落物和根系的腐解程度增大，使土壤C、N 營養隨可分解植物殘茬的微生物增多而持續提高［30，55］，促進碳水化合物、外源物質及萜類和聚酮類化合物代謝，提高其功能基因的豐度。本研究中與代謝相關的二級功能層中碳水化合物代謝、全局概覽通路和氨基酸代謝占比較高，且功能基因豐度隨種植年限延長逐漸增加。其中碳水化合物代謝通過植物光合作用產生并被其他生物消耗，調控生物體內碳水化合物的代謝形成、分解和相互轉化［56］；氨基酸代謝主要通過脫氨作用、轉氨作用、聯合脫氨或脫羧作用分解成α-酮酸、胺類及二氧化碳，氨基酸代謝與植株氮素的循環息息相關［52］。本研究發現種植苜蓿對土壤C、N 有累積作用，且隨種植年限延長累積作用增強，并影響到土壤微生物活性，這與碳水化合物與氨基酸代謝豐度變化相呼應。

4 結論

1）與農田相比，種植紫花苜蓿土壤C、N 營養呈現增加趨勢，P 營養呈現下降趨勢，但速效鉀含量在農田和苜蓿土壤間無明顯差異。

2）半干旱雨養區黃綿土上共檢測到細菌36 門90 綱192 目375 科715 屬，其中門水平優勢群落為放線菌門、變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門；已分類優勢細菌屬包括Gaiella屬、硝化螺菌屬、假節桿菌屬、Solirubrobacter屬。

3）紫花苜蓿土壤Solirubrobacter屬豐度顯著高于農田土壤；隨苜蓿種植年限延長，Gaiella屬和硝化螺菌屬相對豐度逐漸降低，假節桿菌屬、芽球菌屬、鏈霉菌屬和類諾卡氏菌屬相對豐度逐漸增加；冗余分析表明，土壤全磷是影響細菌群落結構的主要環境因子。

4）黃綿土細菌生態功能較為豐富，在新陳代謝、環境信息處理、遺傳信息處理、細胞轉化、人類疾病和生物體系統方面表現活躍，其中農田土壤的代謝、生物體系統功能基因豐度均顯著低于苜蓿土壤，而細胞轉化功能和生物體系統功能基因隨苜蓿種植年限延長顯著增加。