神經(jīng)電刺激對(duì)腦外傷昏迷大鼠前額葉皮質(zhì)5-羥色胺2A和γ-氨基丁酸b受體表達(dá)的影響

李益歡 錢春生 張斌 何云文 陳傳新

(江蘇大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2附屬金壇醫(yī)院神經(jīng)外科)

腦外傷導(dǎo)致的昏迷仍是世界范圍內(nèi)的難題，對(duì)患者本人和家庭的影響巨大〔1〕。近年來(lái)，部分學(xué)者認(rèn)為迷走神經(jīng)電刺激具有一定的促醒潛能，可通過(guò)刺激迷走神經(jīng)對(duì)大腦皮層重要區(qū)域進(jìn)行調(diào)控，但具體機(jī)制尚未闡明〔2〕。5-羥色胺2A受體(5-HT2AR)和γ-氨基丁酸b受體(GABAbR)是腦內(nèi)與睡眠覺(jué)醒密切相關(guān)的物質(zhì)〔3〕。為探究迷走神經(jīng)電刺激對(duì)兩者表達(dá)的影響，本研究對(duì)腦外傷昏迷大鼠進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1 資料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 108只雄性成年SD大鼠(由華西醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，清潔級(jí)，體質(zhì)量250～300 g，自然光照下常規(guī)飼養(yǎng)，室溫保持在23℃左右。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將其分為刺激組、假刺激組和空白組各36只。實(shí)驗(yàn)大鼠均健康，刺激組平均體重(232.7±7.6)g，假刺激組平均體重(233.5±7.7)g，空白組平均體重(233.0±7.5)g，3組大鼠體重?zé)o顯著差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑 (1)MNT冷凍切片機(jī)(德國(guó)SLEE公司)；(2)ES-420型電刺激儀(日本伊藤超短波株式會(huì)社)；(3)Eppendorf 5427 R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(艾本德中國(guó)有限公司)；(4)MY2300全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀(澳大利亞郝思林公司)；(5)兔抗GABAbR抗體(ab75239)和兔抗5-HT2AR抗體(BA47258)均購(gòu)自武漢博士德有限公司；(6)10%水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1腦外傷昏迷大鼠模型制備 通過(guò)自由落體撞擊法制備腦外傷昏迷大鼠模型。具體步驟：將刺激組和假刺激組大鼠放在標(biāo)本缸中，腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.5 ml/100 g)。麻醉后頭頂備皮消毒，逐層切開(kāi)至暴露頂骨。在人字縫與顱頂冠狀縫交點(diǎn)處固定一圓形鐵板。大鼠恢復(fù)后爪疼痛刺激反射時(shí)，采用重400 g的金屬撞擊錘由40 cm高度自由下落撞擊鐵板。撞擊后30 min評(píng)估大鼠意識(shí)狀態(tài)，以翻正反射消失和(或)后爪疼痛反射消失并持續(xù)30 min定義為昏迷狀態(tài)，建模成功〔4〕。

1.3.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程及切片制備 將建模成功的刺激組大鼠仰臥位固定，去除頸毛，在胸骨與喉部間沿正中線取3 cm切口，將胸骨甲狀肌和胸骨舌骨肌分離、固定。找到頸動(dòng)脈鞘后將頸部肌肉和皮膚固定，用止血鉗將左側(cè)迷走神經(jīng)鈍性分離3 cm。將電極連接至左側(cè)迷走神經(jīng)進(jìn)行電刺激(電流1.5 mA，脈寬0.6 ms，頻率25 Hz)，單次刺激時(shí)間30 s，兩次間隔時(shí)間5 min，總刺激時(shí)間5 min。電刺激結(jié)束后去除電極，縫合切口，消毒后放回籠中。假刺激組手術(shù)操作同刺激組，但無(wú)電流輸出。空白組實(shí)驗(yàn)全程無(wú)任何處理。3組于干預(yù)后12 h和24 h時(shí)分別以灌注過(guò)量10%水合氯醛的方式處死18只大鼠。處死后取前額葉皮質(zhì)，先后經(jīng)固定、脫水等處理后制得5 μm切片。

1.3.3免疫組織化學(xué)測(cè)定 將制得的切片首先脫蠟，然后浸泡于75%枸櫞酸鈉溶液中，時(shí)間20 min。后經(jīng)由磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液沖洗(0.02 mol/L)，時(shí)間20 min。室溫條件下，將沖洗后的切片先后經(jīng)20%過(guò)氧化氫浸泡和蒸餾水沖洗，分別為15 min。滴加兔抗GABAbR抗體(1∶300)和兔抗5-HT2AR抗體(1∶300)，靜置12 h(環(huán)境溫度2℃)，染色，于配套顯色盒下顯色。

1.4觀察指標(biāo) (1)定義翻正反射出現(xiàn)為覺(jué)醒，干預(yù)后12 h記錄各組覺(jué)醒大鼠數(shù)量〔5〕；(2)顯微鏡下觀察前額葉皮質(zhì)中GABAbR和5-HT2AR陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，以染色呈棕色或棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算免疫組化(IHC)評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：A表示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量級(jí)，<1%計(jì)0分，1%～10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～80%計(jì)3分，81%～100%計(jì)4分；陽(yáng)性細(xì)胞染色程度分級(jí)用B表示，分別計(jì)0～3分，依次對(duì)應(yīng)陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性。IHC=A×B〔6〕。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.13組大鼠意識(shí)狀態(tài)比較 刺激組和假刺激組大鼠均建模成功。干預(yù)后12 h，3組覺(jué)醒大鼠比例由高到低依次為空白組〔36只(100.0%)〕、刺激組〔27只(75.0%)〕和假刺激組〔13只(36.1%)〕，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.23組不同時(shí)間點(diǎn)前額葉皮質(zhì)5-HT2AR IHC評(píng)分 干預(yù)后12、24 h時(shí)3組前額葉皮質(zhì)5-HT2AR IHC評(píng)分由高到低依次為空白組、刺激組和假刺激組，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。各組不同時(shí)間點(diǎn)前額葉皮質(zhì)5-HT2AR IHC評(píng)分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 3組不同時(shí)間點(diǎn)前額葉皮質(zhì)5-HT2AR IHC評(píng)分比較

空白組

刺激組

假刺激組

2.33組不同時(shí)間點(diǎn)前額葉皮質(zhì)GABAbR IHC評(píng)分比較 干預(yù)后12 h和24 h時(shí)3組前額葉皮質(zhì)GABAbR IHC評(píng)分由高到低依次為假刺激組、空白組和刺激組(均P<0.05)。各組不同時(shí)間點(diǎn)前額葉皮質(zhì)GABAbR IHC評(píng)分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表2，圖2。

表2 3組不同時(shí)間點(diǎn)前額葉皮質(zhì)GABAbR IHC評(píng)分比較

空白組

刺激組

假刺激組

3 討 論

昏迷是腦外傷后最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，約15%腦外傷昏迷患者出院時(shí)仍處于昏迷狀態(tài)，不僅大大降低了整個(gè)家庭的生活質(zhì)量，同時(shí)加重了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，對(duì)于此類病人的促覺(jué)醒治療一直是臨床上不易攻克的難關(guān)〔7〕。神經(jīng)刺激法治療腦外傷昏迷由來(lái)已久，常見(jiàn)方法包括經(jīng)顱磁刺激、正中神經(jīng)電刺激、經(jīng)顱直流電刺激等，效果不甚理想，同時(shí)具有較大的副作用〔8〕。迷走神經(jīng)屬于混合型神經(jīng)纖維，其在大腦皮質(zhì)內(nèi)廣泛性投射的解剖特點(diǎn)一直被認(rèn)為是治療各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)〔9〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，電刺激大鼠的迷走神經(jīng)具有改善認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能的作用，其機(jī)制與抗水腫、保護(hù)血腦屏障和神經(jīng)元等途徑有關(guān)〔10〕。臨床上迷走神經(jīng)電刺激多用于治療偏頭痛、阿爾茨海默病和帕金森病等，效果顯著〔11〕。近年來(lái)，有報(bào)道稱迷走神經(jīng)電刺激可縮短腦外傷后癲癇患者白天快速動(dòng)眼睡眠周期和嗜睡時(shí)間，并延長(zhǎng)覺(jué)醒時(shí)間〔12〕。

本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析迷走神經(jīng)電刺激對(duì)腦外傷昏迷大鼠的促覺(jué)醒作用和機(jī)制，具有較高的臨床意義。本研究干預(yù)后12 h，刺激組覺(jué)醒比例高于假刺激組，與杜青等〔13〕研究的結(jié)果一致，證實(shí)迷走神經(jīng)電刺激具有促昏迷大鼠覺(jué)醒的作用。GABAbR為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的受體，廣泛分布在哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，參與了負(fù)性情緒、癲癇、睡眠等生理或病理過(guò)程；5-HT2AR是5-HTR亞型中分布最為廣泛的一類受體，特別是在前額葉皮層中大量分布，研究認(rèn)為其與覺(jué)醒的調(diào)節(jié)密切相關(guān)〔14,15〕。本研究說(shuō)明迷走神經(jīng)電刺激的促覺(jué)醒作用可能通過(guò)上調(diào)5-HT2AR表達(dá)，下調(diào)GABAbR表達(dá)有關(guān)，假刺激組GABAbR和5-HT2AR的表達(dá)高于空白組可能與腦外傷后的應(yīng)激作用有關(guān)。

本次研究的主要不足有以下3點(diǎn)：(1)實(shí)驗(yàn)樣本量過(guò)小，且僅對(duì)前額葉皮質(zhì)中GABAbR和5-HT2AR的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，其他促覺(jué)醒腦區(qū)是否有所改變尚需進(jìn)一步探究；(2)測(cè)定物質(zhì)表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)較少，因此干預(yù)后不同時(shí)間GABAbR和5-HT2AR變化的結(jié)果存在一定局限性，接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)匯總應(yīng)增加時(shí)間點(diǎn)使結(jié)果更客觀、可靠；(3)迷走神經(jīng)電刺激在臨床上仍屬于有創(chuàng)操作，用于臨床存在一定局限性，如何通過(guò)無(wú)創(chuàng)方法達(dá)到類似效果有待進(jìn)一步研究。