CHD5基因甲基化與結直腸癌臨床病理特征和侵襲能力的關系

唐小鶴 周平 孫美洲 周存金 房玲

(淄博市第一醫院 1消化內一科，山東 淄博 255200；2病理科)

結直腸癌(CRC)是一種常見于胃腸道的惡性腫瘤，其發病率和死亡率僅次于胃癌、原發性肝癌和食管癌，并據2015年中國癌癥統計數據顯示，我國結直腸癌的發病率、死亡率均位居在全部惡性腫瘤中第5 位，其中新發病例37.6 萬，死亡病例19.1 萬。城市地區遠高于農村，且結腸癌的發病率上升顯著〔1,2〕。由于CRC涉及多種基因的激活或失活，并由多個復雜階段的積累而形成，其發生機制目前尚不明確。近年來，抑癌基因(TSG)異常甲基化成為研究者們的焦點，TSG因甲基化而不能正常表達合成抑癌蛋白，細胞抑癌作用被阻斷從而導致單克隆增生，最終形成腫瘤〔3〕。由于TSG異常甲基化在腫瘤的發生發展過程中意義重大，因此為腫瘤發生機制的研究、早期篩查和診斷提供了重要的靶點。CHD5基因于2003年被發現，是位于人類lp36染色體上的抑癌基因，通過p19Art/p53細胞通路調控細胞代謝〔4,5〕。近年來，有報道顯示，CHD5基因甲基化與CRC的臨床表現和發生發展相關〔6〕。本研究擬分析CHD5基因甲基化與CRC臨床病理特征和侵襲能力的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 篩選2016年1月至2017年6月在淄博市第一醫院肛腸外科和腫瘤科經術前活檢或術后病理檢查確診的178例原發性CRC患者，均經過CRC切除術，且術前均未經過化療和放療等輔助治療，且患者術后癌旁組織(距離癌組織至少5 cm以上，病理證實無癌細胞浸潤)及正常組織(手術切緣病理證實無癌細胞浸潤)有完整病例資料和病理鑒定。其中男88例，女90例，年齡41～60歲。所有患者的手術切除率達92.8%，根治性切除率達88.4%。篩選同期本院內鏡科室收集的178例結直腸腺瘤切除組織。其中男71例，女107例，年齡42～61歲。切除組織立即經液氮速凍，超低溫冰箱-80℃冷凍保存。所有研究對象及家屬知情同意并簽署知情同意書，經醫院倫理委員會批準后充分保障研究對象的隱私權。排除標準：重要臟器(心臟、肝臟、腎臟、肺等)嚴重損傷者；血液生化指標嚴重異常；結合患者當時身體情況無法接受手術者；手術切緣病理證實有腫瘤浸潤者。

1.2試劑與設備 主要試劑：氯仿、異丙醇、乙醇購自北京鼎國生物技術責任有限公司；DNA提取試劑盒，亞硫酸鹽修飾試劑盒，購自美國Sigma公司；引物購自北京賽百盛基因技術有限公司；STE試劑、十二烷基硫酸鈉(SDS)購自北京化學試劑公司；RNase A、蛋白酶K購自英國Abcam公司。主要設備：冷凍干燥離心機購自美國Promega公司；高壓蒸汽滅菌器購自德國Thermo Scientific公司；制冰機購自上海斯科茨曼制冰有限公司；紫外可見分光光度計購自德國BRAND公司；CO2恒溫細胞培養箱購自美國熱電公司；超凈工作臺購自北京長城空氣凈化設備公司；超低溫冰箱購自日本三洋株式會社；電子分析天平購自瑞士METTLER公司；PowerPac電泳儀購自美國Bio-RAD公司；PCR擴增儀購自美國ABI公司。

1.3組織細胞處理 分別稱取100 mg組織：①經病理確診的癌組織；②經病理證實無腫瘤浸潤的癌旁組織，與癌組織相距≥5 cm；③經病理證實無腫瘤浸潤的手術切除邊緣正常組織；④腺瘤組織。加入900 μl STE和100 μl 10%SDS后置于勻漿器進行勻漿，之后加入6 μl 200 μg/ml RNase A和10 μl 10 mg/ml蛋白酶K，55℃恒溫酶解60 min。

1.4樣本DNA提取及濃度檢測 依據DNA提取試劑盒操作步驟提取組織DNA。TE溶液對DNA樣品進行20倍稀釋，紫外可見分光光度計在260 mm、280 nm和310 nm處測定OD值，計算OD260/OD280約為1.8即可進行后期實驗，若其大于1.8可能有RNA，小于1.8則可能有蛋白質污染，需進一步再純化。DNA樣品于-20℃保存。

1.5甲基特異性PCR(MSP)檢測CHD5基因甲基化 依據試劑盒說明對提取的DNA進行亞硫酸鹽修飾，以備PCR擴增檢測。甲基化引物：上游：5′-TTAAGGTAGTTTTAAGATTTGTCGTC-3′，下游：5′-TACGAATCTACGATATCTATACCCA-3′，大小197 bp；未甲基化上游：5′-TTTTTAAGGTAGTTTTAAGATTTGTTGTT-3′，下游：5′-TACAAATCTACAATATCTATACCCAA-AA-3′；大小191 bp。擴增程序：95℃ 30 s，95℃ 5 s，57℃ 20 s，72℃ 20 s，40個循環。

1.6甲基化判定 利用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，判定條件：(1)電泳圖中若只出現未甲基化條帶，計為未甲基化；(2)若出現甲基化條帶，計為甲基化；(3)若既出現甲基化條帶又出現未甲基化條帶，計為甲基化。

1.7RT-PCR檢測CHD5 mRNA表達 提取組織RNA，CHD5上游引物：5′-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC-3′，下游引物：5′-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG-3′；大小108 bp；ATCB上游引物：5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′，下游引物：5′-GGTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3′；大小156 bp。目的基因CHD5和管家基因ATCB的擴增條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，61℃ 20 s，72℃ 20 s，40個循環。以管家基因ATCB作為內參，△Ct=△Ct目的-△Ct內參，RNA的相對表達量=2-△Ct。

1.8統計學方法 使用SPSS18.5統計軟件進行單因素方差分析、LSD法分析。

2 結 果

2.1各組織中CHD5基因甲基化比例 正常組織甲基化率為12.36%(22/178)；癌旁組織甲基化率為23.60%(42/178)，差異無統計學意義(P=0.24)；腺瘤組織甲基化率為47.75%(85/178)，與正常組織、癌旁組織比較，差異有統計學意義(P=0.01、0.02)；CRC組織的甲基化率為72.47%(129/178)，與正常組織、癌旁組織和腺瘤組織比較差異有統計學意義(P=0.00、0.00、0.02)。

2.2CHD5基因甲基化與CRC臨床病理學的關系 CHD5基因甲基化率與CRC分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期有密切相關性(P<0.05)；與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類型和浸潤深度無相關性(P>0.05)。見表1。

表1 CHD5基因甲基化與CRC臨床病理學的關系〔n(%)〕

2.3CHD5基因甲基化與CRC腺瘤的臨床病理學關系 CHD5基因甲基化率與CRC患者腺瘤病理類型有密切相關性(P<0.05)；與患者性別、年齡、腺瘤部位、腺瘤直徑和腺瘤數量無相關性(P>0.05)。見表2。

表2 CHD5基因甲基化與CRC腺瘤的臨床病理學的關系〔n(%)〕

2.4各組織中CHD5 mRNA表達比較 正常組織中CHD5 mRNA表達為(0.246±0.019)，癌旁組織為(0.173±0.014)，腺瘤CHD5 mRNA為(0.159±0.009)，癌組織CHD5 mRNA為(0.015±0.018)，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

目前在大多數國家中，CRC的發病率逐年呈上升趨勢，尤其在中國，有報道顯示，高脂低纖的不健康飲食方式、肥胖綜合征、家族遺傳和腸道炎癥等是主要的誘病因子〔7～9〕。CRC的致病、轉移、復發機制尚不完全明確，主要過程如下：①上皮細胞異常增生；②腺管和腺瘤異常增生；③細胞發生浸潤形成癌。CRC的早期癥狀并不明顯，容易被忽視，隨著癌細胞的擴增常伴有便秘、便血、腹瀉、腹瀉與便秘不間斷交替、腹痛等癥狀，癌癥晚期常表現為貧血、體重減輕、四肢無力等癥狀〔10〕。目前臨床上主要通過糞便隱血法、血清CEA檢測及影像學(B超或CT)等來進行CRC早期篩查或術后復發檢測轉移病灶〔11〕。但這些方法通常具有敏感性較低，假陰性率高，特異性差，不能發現較小早期復發等缺陷，因此，探尋靈敏性更強的方法對于CRC的預測、篩查、發現早期復發或轉移有極為重要的意義。

DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶的作用下，胞嘧啶的第5位碳原子上加上一個甲基基團，從而改變染色質的空間構象，抑制DNA轉錄和表達，使之長期處于靜默狀態〔12〕。若抑癌基因發生異常甲基化，直接抑制其正常轉錄和翻譯，不能合成抑癌蛋白，最終就可導致腫瘤。最早在視網膜母細胞瘤(RB)的研究中發現抑癌基因的高度甲基化，通過DNA CpG島的高甲基化修飾抑制抑癌基因的轉錄從而引發腫瘤〔13〕。CHD5是定位于人類1號染色體短臂3區6帶上的抑癌基因，在甲狀腺癌、結腸癌、宮頸癌、乳腺癌、黑色素瘤〔14〕等多種惡性腫瘤中，均發現其表達的下調或靜默，其關注度也越來越高。近年來有研究發現CHD5基因甲基化與其表達下調或缺失有直接關聯〔13，15，16〕。Sagimoto等〔17〕研究發現CHD5發生甲基化導致基因抑制是食管癌發生的重要機制之一。李曉陽等〔18〕也發現CHD5基因因高度甲基化，在7種胃癌細胞培育株中均出現表達下調。游焜等〔6〕通過檢測63例胃癌組織及相應的癌旁組織發現CHD5的轉錄和翻譯均低于正常組織。這些研究均證實CHD5基因的甲基化與胃癌的臨床病理程度和侵襲能力關系密切〔19〕。

賴曉波等〔20〕發現CHD5 mRNA的表達在癌旁組織和遠端正常組織中高于癌組織，推斷出CHD5 mRNA的表達與CRC的侵襲程度和發生發展密切相關。本研究結果說明CHD5甲基化致使CHD5 mRNA表達下降，癌細胞侵襲能力增強。馬棟等〔21〕結合相應的病理特征，發現不同國家CRC患者中，非裔美國人CHD5基因甲基化水平高于伊朗人，差異具有顯著性，可間接推斷出CHD5基因甲基化與地域、飲食習慣等有關。本研究結果還表明CHD5基因甲基化作用于CRC的整個發展過程，但其發病因素尚不明確。根據研究提示，約80%的CRC系由結直腸腺瘤演變而來，其演變過程需要7～10年〔22～24〕，而管狀-絨毛狀腺瘤的惡變率高達 19.51%～33.60%〔25～27〕，本研究表明CHD5基因甲基化率與CRC患者腺瘤病理類型有密切相關性，其中絨毛狀腺瘤甲基化率最高，由此可推斷出絨毛狀腺瘤病變惡化的概率更大，CHD5基因甲基化與CRC的早期發生相關聯〔22〕。綜上，抑癌基因CHD5的DNA甲基化檢測可應用于CRC的預測、篩查、病情監測及預后判斷，對患者手術及術后治療方案的制訂和預后具有重要意義。