姜黃素衍生物C086通過PI3K-Akt通路誘導肝癌HepG2細胞凋亡

郭登方 王若濤 黃建成 王瑞華 張揚平 張春

(福建醫科大學附屬寧德市閩東醫院 1普外科，福建 寧德 355000；2檢驗科)

盡管近年來治療肝細胞癌(HCC)的方法有大幅度改善〔1,2〕，但終末期HCC患者死亡率依然很高，且HCC早期診斷率低，一經發現多已進入HCC終末期，極易擴散，使HCC治愈變得異常艱難〔3〕，因此尋找新的治療途徑變得非常迫切。姜黃素是一種從姜黃根莖中提取的天然化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗纖維化等多種藥理作用，且對人體毒性小〔2〕。姜黃素衍生物-4(4-甲基-3氧基苯甲基，C086)是一種新合成的姜黃素衍生物，其生物活性優于姜黃素，具有良好抗突變和抗腫瘤作用〔4〕。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路是一種重要的凋亡抑制通路，在腫瘤細胞的增殖、活化和遷移等方面發揮重要調控作用〔5〕。本研究利用C086處理HCC HepG2細胞，擬觀察C086對HCC HepG2細胞凋亡的影響并初步探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 人HepG2細胞系購自美國ATCC，RPMI1640培養基(批號：11875193)、胎牛血清(FBS，批號：10099-145)購自美國Gibco公司；姜黃素C086(批號：20180305，純度≥98.5%)購自北京索萊寶生物科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO，批號：ST038)、四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒(批號：C0009)、細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒(批號：P0028)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(批號：P0010S)、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(批號：C1062S)購自上海碧云天；鼠源一抗β-actin抗體、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2抗體、 Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體、PI3K抗體、p-PI3K抗體、AKT抗體、p-AKT抗體、細胞色素(Cyt)C抗體，二抗羊抗鼠IgG(批號：B-2752)均購自美國Invitrogen；酶標儀、5%CO2培養箱購自美國Thermo Fisher；流式細胞儀購自美國BD；倒置顯微鏡購自日本Olympus等。

1.2試驗方法

1.2.1MTT法檢測HepG2細胞增殖 取培養至對數生長期的HepG2細胞接種于96孔細胞板中繼續培養，每孔接種細胞數量約0.5×105個，每孔體積200 μl；細胞完全貼壁后更換培養基并加入不同濃度C086(0、10、20、40 μmol/L)分別培養24 h、48 h、72 h，每組6個重復。培養結束前4 h每孔加入MTT(5 g/L)20 μl，培養結束后棄去上清液，每孔加200 μl DMSO，輕微震蕩10 min，待MTT沉淀物徹底溶解后上酶標儀，檢測各孔570 nm吸光度(A)值，并記錄結果。細胞增殖率=(C086 A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

1.2.2流式細胞儀檢測HepG2細胞凋亡 檢測HepG2細胞凋亡采用Annexin V-FITC/PI雙染色法，取生長至對數期的HepG2細胞約2×105個/孔接種于6孔細胞培養板中，待細胞匯合至80%時，C086處理及對照組設置同上。培養48 h后每孔500 μl結合緩沖液重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μl PI，避光輕輕振蕩混勻，室溫放置15 min。同時設置陰性對照(無Annexin V-FITC和PI)，放入流式細胞儀檢測HepG2細胞凋亡率。

1.2.3流式細胞儀檢測HepG2細胞線粒體膜電位 取生長至對數期的HepG2細胞按5×105個/ml接種于6孔細胞培養板中，添加培養基3 ml、C086(0、10、20、40 μmol/L)各100 μl培養48 h，待細胞匯合至90%，重懸細胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌重懸細胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入1 mmol/L羅丹明123，37℃孵育15 min，PBS洗滌2次，重懸細胞，放置流式細胞儀FL1通道檢測。

1.2.4Western印跡檢測HepG2細胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Bax、Bcl-2、Cyt C蛋白表達 收集不同濃度C086處理過的細胞，用預冷PBS洗滌后，嚴格按照蛋白提取試劑盒操作說明提取細胞總蛋白，蛋白濃度采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行測定，提取的蛋白置于-80℃保存備用。加入1/5體積6×SDS上樣緩沖液，95℃ 5 min，冷卻離心后置于-20℃保存備用。取 80 μg蛋白樣品，以β-actin做為內參，6% SDS-PAGE 電泳。用濕轉法將膠上蛋白轉移至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋，加一抗(PI3K、p-PI3K抗體1∶500；AKT、p-AKT抗體1∶1 000；Bcl-2抗體1∶500；Bax抗體1∶500；Cyt C抗體1∶500；β-actin抗體1∶500)4℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜3次，每次20 min，用適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗IgG(1∶5 000)室溫孵育 1.5 h，按上述方法洗膜，用化學發光試劑(ECL)顯色，數字化多功能圖像增強化學發光系統曝片，觀察結果并進行分析。

1.3統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1C086對HepG2細胞增殖的作用 MTT結果顯示，與0 μmol/L 組比較，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L C086處理組HepG2細胞增殖抑制率顯著增加(P<0.05)；與10 μmol/L 組比較，20 μmol/L、40 μmol/L C086處理組HepG2細胞增殖抑制率顯著增加(P<0.05)；與20 μmol/L組比較，40 μmol/L C086處理組HepG2細胞增殖抑制率顯著增加(P<0.05)；且隨著作用時間的延長HepG2細胞增殖抑制率顯著增加，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度C086對HepG2細胞增殖抑制率的影響

2.2C086對HepG2細胞凋亡的影響 流式細胞儀分析結果顯示，與0 μmol/L 組比較，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L C086組HepG2細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與10 μmol/L組比較，20 μmol/L、40 μmol/L C086組HepG2細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與20 μmol/L組比較，40 μmol/L C086 組HCC HepG2細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 流式細胞儀檢測C086對HepG2細胞凋亡的影響

表2 不同濃度C086對HepG2細胞凋亡及細胞膜電位的影響

2.3C086對HCC HepG2細胞線粒體膜電位的影響 與0 μmol/L組比較，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L C086 組HepG2細胞線粒體膜電位均顯著降低(均P<0.05)；與10 μmol/L組比較，20 μmol/L、40 μmol/L C086 組HepG2細胞線粒體膜電位均顯著降低(均P<0.05)；與20 μmol/L組比較，40 μmol/L C086 組HepG2細胞線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.4C086對Bax、Bcl-2、半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3及Cyt C蛋白表達的影響 與0 μmol/L組比較，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L C086 組Bcl-2蛋白水平均顯著下調，caspase-3、Bax、Cyt C蛋白水平均顯著上調(P<0.05)；與10 μmol/L組比較，20 μmol/L、40 μmol/L C086 組Bcl-2蛋白水平均顯著下調，caspase-3、Bax、Cyt C蛋白水平均顯著上調(均P<0.05)；與20 μmol/L比較，40 μmol/L C086組Bcl-2蛋白水平均顯著下調，caspase-3、Bax、Cyt C蛋白水平均顯著上調(均P<0.05)。見圖2、表3。

1～4：0 μmol/L組、10 μmol/L組、20 μmol/L組、40 μmol/L組、下圖同圖2 Western印跡檢測caspase-3、Bax、Cyt C和Bcl-2蛋白表達

表3 C086對HepG2細胞caspase-3、Bax、Cyt C和Bcl-2蛋白表達的影響

2.5C086對PI3K、AKT及p-AKT蛋白表達的影響 與0 μmol/L組比較，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L C086組p-PI3K及p-AKT蛋白水平均顯著下調(均P<0.05)；與10 μmol/L組比較，20 μmol/L、40 μmol/L C086 組p-PI3K及p-AKT蛋白水平均顯著下調(均P<0.05)；與20 μmol/L比較，40 μmol/L C086 組p-PI3K及p-AKT蛋白水平顯著下調(P<0.05)；0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L C086各組PI3K、AKT蛋白水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3，表4。

圖3 Western印跡檢測PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT蛋白表達表達

表4 C086對HepG2細胞PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT蛋白表達的影響

3 討 論

HCC是消化系統常見惡性腫瘤之一，分為原發性和繼發性兩大類，其中原發性肝癌在我國發病率極高，死亡率也高，嚴重危協人類健康〔6〕。HCC的發生發展過程極其復雜，目前治療方式主要包括手術切除、放化療及肝臟移植等，但療效都不理想，因此尋找新的治療方法和途徑成為目前迫切需要解決的問題〔7〕。許多研究報道，一些植物提取物，比如姜黃素〔8〕、白蘆藜醇〔9〕、綠茶〔10〕等藥理作用廣泛且對人體毒性低，在癌癥及腫瘤預防和治療過程中起到非常積極的作用，但其作用機制尚不完全清楚。

姜黃素是一種多酚類植物提取物，具有抗突變和抑制腫瘤作用，研究發現，它在多種腫瘤細胞、腫瘤干細胞及臨床實體腫瘤中均具有抗腫瘤活性〔11〕，應用前景廣闊。C086是以姜黃素為先導新合成的一種姜黃素衍生物，王曉露等〔4〕研究發現C086可通過抑制癌基因C-myc和STAT-3蛋白表達，抑制胰腺癌細胞Panc-1的侵襲和轉移。C086在肝癌細胞中的作用尚鮮有報道。本研究結果發現不同濃度C086處理HCC HepG2細胞，可濃度依賴性抑制HCC HepG2細胞增殖、促進HCC HepG2細胞凋亡，但具體機制不清楚。

Da等〔12〕研究發現，線粒體在細胞凋亡過程中起非常關鍵作用，線粒體膜電位與線粒體膜通透性呈負相關，線粒體膜通透性取決于線粒體外膜與內膜間隙由多種蛋白組成的線粒體膜通透性轉運孔(MPTP)的開放〔13〕。線粒體間隙存在CytC、鈣離子、細胞促凋亡因子等，MPTP開放導致線粒體膜電位改變，使線粒體內部Cyt C和促凋亡因子等外流，進而激活細胞凋亡通路，增加促凋亡蛋白的表達〔14〕。Bcl-2的生理功能是阻遏細胞凋亡，延長細胞壽命〔15〕，它在不同細胞類型中可定位于內質網、線粒體和核膜上，通過阻止線粒體Cyt C的釋放發揮抗凋亡作用〔16〕。caspase-3在細胞凋亡中起不可替代的作用，是一種凋亡執行蛋白；Bax是人體主要凋亡基因，屬于Bcl-2家族，與Bcl-2是拮抗關系。有研究發現Bax/Bcl-2 兩蛋白之間的比例關系是決定細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素〔10〕。本研究結果發現，C086呈濃度依賴地降低HCC HepG2細胞線粒體膜電位，下調Bcl-2蛋白表達，上調caspase-3、Bax和Cyt C蛋白表達，提示C086可增加線粒體通透性，使線粒體膜電位改變，Cyt C外流，上調caspase-3、Bax和阻止Bcl-2蛋白表達。

PI3K-AKT通路廣泛存在于細胞中，參與細胞的增殖分化過程〔17〕。有研究發現，PI3K-AKT通路在細胞凋亡過程中起到非常重要的作用。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可使自身和其他多種蛋白磷酸化發揮生物學活性，AKT在PI3K-AKT通路中發揮非常關鍵作用，AKT活性升高可以抑制細胞凋亡〔12〕。PI3K同時具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性，在被激活可使細胞膜上的肌醇發生磷酸化后變成第二信使，與其下游效應分子AKT結合后使AKT發生磷酸化變成p-AKT，進而可編碼下游凋亡蛋白caspase-3、Bax、Cyt C和Bcl-2等〔18〕。本研究結果提示C086可能通過抑制PI3K-AKT通路抑制HepG2細胞增殖、促進HepG2細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用。Zhou等〔19〕研究指出，猴頭菌素可以促進MPTP開放，使Cyt C釋放增加，進而激活PI3K-Akt通路抑制HCC細胞增殖、轉移和侵襲，促進HCC細胞凋亡；Liu等〔20〕研究發現，瑞舒伐他汀可通過誘導PI3K-AKT和GSK-3β發生磷酸化，進而促進MPTP開放，防止心肌缺血-再灌注損傷。因此本研究推測C086可能通過PI3K-AKT通路促進MPTP開放，增加線粒體膜通透性，導致HepG2細胞中caspase-3、Cyt C、Bax蛋白增加和Bcl-2蛋白減少，抑制HepG2細胞增殖、促進其凋亡。