自交聯透明質酸鈉凝膠對大鼠宮腔粘連形成的預防作用及對NF-κB相關因子的影響

楊雅嵋 何浩 王文平 冉偉 曾玉華

(川北醫學院附屬醫院 1婦產科，四川 南充 637000；2重癥醫學科)

自交聯透明質酸鈉凝膠是目前臨床上常用的防止宮腔粘連(IUA)方法，相容性好、流動性強、半衰期長〔1，2〕，但具體機制尚不明確。IUA伴隨炎癥反應；同時引起纖維細胞增生，而纖維細胞增生受纖維蛋白的調控〔3〕；已有研究表明大鼠陰道炎、宮頸炎、盆腔炎等疾病中炎癥水平升高、纖維細胞增生影響疾病進程〔4,5〕。因此降低機體炎癥水平、降低組織纖維化對緩解IUA極為重要。本研究建立IUA模型，觀察自交聯透明質酸鈉凝膠對IUA大鼠的保護作用并探討對核轉錄因子(NF)-κB相關因子的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級健康SD雌性未孕性成熟大鼠〔川北醫學院實驗動物中心，許可證號：SCXK(川)2017-0025〕，體重200～220 g。所有大鼠在溫度(25±1)℃、濕度(50±10)%、光照/黑暗12 h/12 h的實驗動物中心常規飼養1 w進行后續實驗。實驗均經醫院動物實驗倫理委員會批準。

1.2試劑與儀器 苯酚(上海麥克林生化科技有限公司，批號：108-95-2)，自交聯透明質酸鈉凝膠(安徽引導者醫療科技有限公司，批準文號：3641453)，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術有限公司，批號：C0105)，Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：G1340)，大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1、IL-18酶聯免疫(ELISA)試劑盒，一抗NF-κB抗兔、轉化生長因子(TGF)-β1抗兔、結締組織生長因子(CTGF)抗兔、膠原蛋白(collagen )Ⅲ抗鼠、collagen Ⅰ抗鼠、內參GAPDH抗鼠、二抗羊抗鼠、羊抗兔(英國abcam，批號分別為：ab208348、ab100704、ab216165、ab238420、ab179695、ab125943、ab6310、ab6308、ab8245、ab150117、ab150077)，RNA提取試劑盒(美國Invitrogen，批號：12183020)，cDNA反轉錄試劑盒(美國Fermentas，批號：K1622)，2×Hi SYBR Green QPCR Mix(北京百奧萊博科技有限公司，編號：PC3301)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑(上海生工生物工程有限公司，批號：PW017)。實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)儀(美國ABI，型號： StepOnePlus)，蛋白凝膠成像儀(上海天能科技有限公司，型號：4800)。

1.3方法

1.3.1動物造模 參照文獻中方法動物造模〔6〕。造模前液化苯酚5 ml、甘油4 ml、阿拉伯樹膠1 g，加蒸餾水至20 ml，配制25%苯酚膠漿待用。24只雌性性成熟未孕SD大鼠選取6只為空白組不做任何處理；其余18只麻醉后，在下腹部正中、尿道上端約1.0 cm處切開皮膚組織，暴露出子宮，隨機選取6只大鼠為假手術組，4號針頭在子宮分叉處向卵巢方向注0.04 ml生理鹽水；其余12只同樣方法注0.04 ml 25%苯酚膠漿構建大鼠IUA模型，肉眼可見宮腔隆起即為注射成功。IUA組不做處理，IUA+自交聯透明質酸鈉組硬脊膜暴露區創傷面涂抹1%自交聯透明質酸鈉凝膠0.5 ml/kg〔7〕。所有打開腹腔動物用無菌絲線逐層縫合。各組禁食但不禁水12 h后常規飼養，7 d后檢測各指標。

1.3.2HE、Masson染色觀察子宮組織變化 造模7 d后腹腔注射麻醉處死所有大鼠，立即打開腹腔取出子宮組織。每個樣本部分組織放-20℃做ELISA實驗、部分組織移至-80℃冰箱做qRT-PCR、蛋白免疫印跡(WB)實驗、部分放于4%多聚甲醛中固定。固定于4%多聚甲醛中的子宮組織過夜后至酒精中脫水，二甲苯中透明，置于溶化的石蠟包埋、冷凍凝固后切片。部分切片HE染色試劑盒染色，光學顯微鏡拍照觀察子宮組織形態學變化，測微標尺測量子宮內膜厚度，每組隨機選6張切片求平均值為該組子宮內膜厚度。切片每組選6個用Masson染色試劑盒染色，光學顯微鏡拍照觀察子宮組織變化，每個切片隨機選取3個視野，計算每個視野下子宮內膜纖維化面積的比例，求其平均值即為該子宮組織內膜間質纖維化面積占子宮內膜面積的比例。

1.3.3ELISA檢測大鼠子宮組織中TNF-α、IL-1、IL-18水平 -20℃冰箱凍存組織去除血液后組織勻漿。5 000 r/min離心5 min，收集上清后分裝待測。嚴格按照大鼠TNF-α、IL-1、IL-18 ELISA試劑盒說明書步驟操作。

1.3.4qRT-PCR檢測大鼠子宮組織中NF-κB、TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ mRNA水平 取-80℃冰箱部分凍存組織，RNA提取試劑盒提取子宮組織總RNA，cDNA反轉錄試劑盒反轉錄cDNA，qRT-PCR儀對NF-κB、TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ、GAPDH擴增。引物序列見表1。上樣體系：cDNA 1 μl(50 ng/μl)，F/R(10 μmol/L)各0.5 μl，2×Hi SYBR Green QPCR Mix 10 μl，雙蒸水(ddH2O) 8.0 μl。反應條件：95℃、90 s；95℃、30 s；62℃、55 s；45個循環。2-ΔΔCt法對子宮組織中NF-κB、TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ、GAPDH表達水平定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.5WB檢測大鼠子宮組織中NF-κB、TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ蛋白水平 每個樣品取30 mg凍存組織冰上研磨，每管加1 ml蛋白裂解液冰上裂解30 min，提取子宮組織總蛋白，凝膠電泳分離蛋白質后PVDF膜280 mA轉膜1 h；5%脫脂奶粉封閉2 h；加入對應一抗NF-κB、TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ、GAPDH，4℃孵育過夜；加入對應二抗，室溫孵育1 h。DAB顯色試劑顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.4統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.14組HE染色檢測子宮組織變化 空白組、假手術組子宮內膜、腎上腺和宮腔組織結構完整，子宮內膜壁光滑有彈性、粗細均勻，腎上腺細胞豐富。IUA組子宮內膜粗糙且彈性差，內膜層細胞壞死嚴重，腎上腺細胞缺失，腔上皮細胞結構不完整，可見宮腔粘連緊密。IUA+自交聯透明質酸鈉組可觀察到子宮內膜、腎上腺和宮腔組織，子宮內膜變厚但卻粗糙，無宮腔粘連現象。見圖1。與空白組〔(779.59±158.63)μm〕相比，IUA組、IUA+自交聯透明質酸鈉組子宮內膜厚度顯著變薄〔(405.82±112.69)μm、(582.68±132.51)μm；P<0.05〕；與假手術組〔(735.56±169.52)μm〕相比，IUA組子宮內膜厚度顯著變薄(P<0.05)；與IUA組相比，IUA+自交聯透明質酸鈉組子宮內膜厚度顯著變厚(P<0.05)。

箭頭所指為宮腔粘連處圖1 4組HE染色檢測子宮組織變化(×200)

2.24組Masson染色檢測子宮組織變化 與空白組〔(37.65±8.75)%〕相比，IUA組、IUA+自交聯透明質酸鈉組纖維化面積顯著擴大〔(86.73±15.56)%、(54.52±10.61)%；P<0.05〕；與假手術組〔(38.85±9.16)%〕相比，IUA組、IUA+自交聯透明質酸鈉組纖維化面積顯著擴大(P<0.05)；與IUA組相比，IUA+自交聯透明質酸鈉組纖維化面積顯著縮小(P<0.05)。見圖2。

圖2 4組Masson染色檢測子宮組織變化(×200)

2.34組子宮組織炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-18變化情況 與空白組及假手術組相比，IUA組子宮組織TNF-α、IL-1、IL-18表達量顯著升高，IUA+自交聯透明質酸鈉組子宮組織IL-1、IL-18表達量顯著升高(P<0.05)；與空白組和假手術組相比，IUA+自交聯透明質酸鈉組子宮組織IL-1、IL-18表達量顯著升高(P<0.05)；與IUA組相比，IUA+自交聯透明質酸鈉組子宮組織TNF-α、IL-1、IL-18表達量顯著下降(P<0.05)。見表2。

表2 4組子宮組織炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-18水平及NF-κB mRNA、蛋白表達比較

2.44組子宮組織NF-κB mRNA變化情況 與空白組及假手術組相比，IUA組、IUA+自交聯透明質酸鈉組子宮組織NF-κB mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與IUA組相比，IUA+自交聯透明質酸鈉組子宮組織NF-κB mRNA水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.54組子宮組織NF-κB蛋白變化情況 與空白組及假手術組相比，IUA組子宮組織NF-κB蛋白水平升高(P<0.05)；與IUA組相比，IUA+自交聯透明質酸鈉組子宮組織NF-κB蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見表2、圖3。

1～4：空白組；假手術組；IUA組；IUA+自交聯透明質酸鈉組；圖4同圖3 4組子宮組織NF-κB蛋白水平比較

2.64組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ mRNA變化情況 與空白組及假手術組相比，IUA組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ mRNA表達顯著升高，IUA+自交聯透明質酸鈉組子宮組織TGF-β1、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ mRNA表達顯著升高(P<0.05)；與IUA組相比，IUA+自交聯透明質酸鈉組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ mRNA表達顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 4組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ mRNA水平比較

2.74組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ蛋白變化情況 與空白組相比，假手術組子宮組織collagen I蛋白表達顯著升高，IUA組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ蛋白表達顯著升高，IUA+自交聯透明質酸鈉組子宮組織TGF-β1、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與假手術組相比，IUA組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ蛋白表達顯著升高，IUA+自交聯透明質酸鈉組子宮組織TGF-β1、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與IUA組相比，IUA+自交聯透明質酸鈉組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖4、表4。

圖4 4組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ蛋白水平比較

表4 4組子宮組織TGF-β1、CTGF、collagen Ⅲ、collagen Ⅰ蛋白水平比較

3 討 論

IUA也稱Asherman綜合征，是子宮內膜基底層破壞無法修復，致使肌層組織裸露而引起宮壁組織相互粘連疾病，已成為月經稀少、復發性流產、不孕不育的重要原因〔7〕，是婦科常見宮腔疾病之一，多次人工流產、刮宮致IUA發生率已高達25%～30%〔8〕。宮腔鏡IUA分離術是治療IUA的標準術式，然而術后再粘連率高達62.5%，因此防止IUA分離術后再粘連是治療IUA的關鍵。研究表明，自交聯透明質酸鈉相較于自然透明質酸鈉凝膠具有半衰期長且不易降解特點，為預防IUA提供了可能〔9〕。苯酚膠漿法模擬IUA癥狀，苯酚膠漿處理大鼠后內膜層細胞壞死嚴重、子宮內膜粗糙且彈性差，可見宮腔粘連緊密現象并且組織纖維化嚴重；測量發現子宮內膜厚度變薄，提示IUA造模成功。IUA涂抹自交聯透明質酸鈉后子宮內膜變厚、組織纖維化面積變小，無IUA現象；提示自交聯透明質酸鈉可減緩IUA癥狀，可增加子宮內膜厚度、降低組織纖維化。

炎癥因子TNF-α是炎癥反應中出現最早、最重要的炎癥介質〔10〕，IL-1是體內最強的炎癥介質之一〔11〕，IL-18的胞內信號轉導通路與IL-1家族類似，可在多種疾病中爆發加重疾病進程〔12〕。本研究發現，空白組與假手術組子宮組織中TNF-α、IL-1、IL-18差異不明顯，提示手術對炎癥的影響不明顯；與假手術組相比，IUA組子宮組織中TNF-α、IL-1、IL-18表達升高，提示IUA可加強子宮組織中炎癥因子水平從而加重疾病；與IUA組相比，IUA+自交聯透明質酸鈉組子宮組織TNF-α、IL-1、IL-18表達量下降，提示自交聯透明質酸鈉可緩解IUA引起的炎癥因子水平升高現象。

NF-κB是激活炎癥反應發生的中心環節，肺間質纖維化是肺泡炎發生的中心環節〔13〕。在IUA研究中發現，IUA發生受多條信號通路的調控〔14〕，其中NF-κB位于中心環節，是TGF-β1上游調節基因之一，激活后可與TGF-β1 啟動子結合，誘導TGF-β1的表達〔15〕；而TGF-β1是多種調控的生長因子；下游CTGF主要集中在成纖維細胞和損傷組織內，可使組織促纖維化；纖維化的主要成分為collagen Ⅲ和collagen Ⅰ〔16～18〕。研究發現，NF-κB與TGF-β1啟動子結合，可誘導腸道狹窄處CTGF的分泌，從而促進成纖維細胞過度增殖、加強間質細胞收縮力、增強合成膠原蛋白〔19,20〕。本研究提示IUA中NF-κB水平升高，可能通過激活炎癥因子使子宮組織炎癥水平升高，同時可能與TGF-β1啟動子結合誘導子宮組織纖維化加速IUA進程。自交聯透明質酸鈉可降低IUA引起的子宮組織中NF-κB升高現象，降低子宮組織中炎癥因子水平、TGF-β1等致纖維環基因表達，減緩子宮組織炎癥、纖維化水平達到保護IUA目的。

綜上，自交聯透明質酸鈉對IUA大鼠子宮組織具有保護作用，可緩解IUA引起的子宮組織NF-κB、炎癥因子及纖維化相關蛋白升高現象。