龍膽苦苷對骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨組織損傷和軟骨細(xì)胞凋亡的作用

王富軍 賈峰 張世華

(1淄博市第一醫(yī)院骨傷科，山東 淄博 255200；2山東省中醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)〔1〕主要特征為關(guān)節(jié)軟骨變性、骨質(zhì)增生等〔2〕。目前我國骨性關(guān)節(jié)炎總患病率約為15%，其致殘率可高達(dá)50%以上〔3〕。Son等〔4〕研究表明雌激素替代治療能夠起到保護(hù)軟骨細(xì)胞，降低OA發(fā)生率。目前OA發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，可能和生物力學(xué)、生物化學(xué)、炎癥等有著密切的關(guān)系〔5〕。龍膽苦苷(GPS)又稱龍膽苦甙，是龍膽科龍膽屬植物龍膽的有效成分之一，屬于裂環(huán)環(huán)烯醚萜類，主要從龍膽和秦艽中提取，具有抗炎、鎮(zhèn)痛的作用〔6，7〕。GPS可抑制人肝癌細(xì)胞的增殖的能力，且GPS清除氧自由基能力在一定濃度范圍內(nèi)隨著濃度增加而增強(qiáng)〔8〕。本文旨在研究GPS對OA大鼠軟骨組織損傷和軟骨細(xì)凋亡作用的影響。

1 材料與方法

1.1動物 75只6周齡SPF級大鼠體重(180±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK(京)2017-0022，普通級，分15個(gè)籠子飼養(yǎng)，每個(gè)籠子5只。

1.2藥物與試劑 GPS(純度>98%；CAS號：20831-76-9)購自南京廣潤生物制品有限公司；胰島素樣生長因子(IGF)1抗體、人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13試劑盒、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β活化激酶(TAK)1抗體購自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；p-p65抗體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；ADAMTs-4 (H-74)抗體購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司；白細(xì)胞介素(IL)-6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、腫瘤壞死因子(TNF)-α測試酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自上海百蕊生物科技有限公司；蘇木素、伊紅購自武漢博士得生物有限公司；甲醛、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司。

1.3儀器 Sysmex-chemix-180 型全自動生化分析儀購自日本 Furuno Electric公司；BS-124s 型電子天平購自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；TDL-5 型臺式離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠；光學(xué)顯微鏡購自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司；切片機(jī)購自德國Leica公司；低溫離心機(jī)購自湖南恒諾離心機(jī)有限公司。

1.4建立模型 建立模型方法參考劉獻(xiàn)祥〔9〕的改良Hulth造模法復(fù)制大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型。將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，取大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，摘除內(nèi)側(cè)半月板，切斷前交叉韌帶。術(shù)后連續(xù)3 d青霉素20萬U肌肉注射，1 w后開始每天強(qiáng)迫兔活動0.5 h，連續(xù)16 w。模型成功與否根據(jù)Rogart等〔10〕研究得出的方法判斷。

1.5分組及藥物干預(yù) 將75只分為假手術(shù)(Sham)組、模型(OA)組、GPS 50 mg/kg組、GPS 100 mg/kg、龍膽苦苷200 mg/kg組(GPS 200 mg/kg)各15只。分別使用對應(yīng)濃度的GPS給大鼠灌胃，Sham組和OA組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，共8 w。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色和番紅染色 HE染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后使用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ分別浸泡20 min，使用無水酒精、95%酒精、80%酒精、70%酒精分別浸泡2 min再使用蒸餾水浸泡2 min；將切片放入蘇木素染色3 min，水洗3遍后使用1%鹽酸酒精分化12 s，使用自來水沖洗返藍(lán)20～30 min，再0.5%伊紅水溶液復(fù)染10 min，水洗3遍；再次使用梯度酒精脫水，使用二甲苯透明后中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠關(guān)節(jié)軟骨的組織形態(tài)。

番紅染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后使用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ分別浸泡20 min，使用無水酒精、95%酒精、80%酒精、70%酒精分別浸泡2 min再使用蒸餾水浸泡2 min；將切片放入番紅O染液染色4 min，水洗2遍，再次使用梯度酒精脫水，使用二甲苯透明后中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠關(guān)節(jié)軟骨的組織形態(tài)。

1.7ELISA檢測IL-6、iNOS、TNF-α含量 從頸總動脈插管接取2 ml 大鼠血液，按照IL-6、iNOS、TNF-α試劑盒子上的操作方法使用ELISA檢測大鼠血清中的IL-1β、IL-6及TNF-α含量。

1.8Western印跡檢測蛋白表達(dá)水平 按照Western印跡檢測方法操作，使用蛋白質(zhì)條帶用掃描儀進(jìn)行掃描，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Imagaquent5.1軟件對MMP-13、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cl-caspase)-3、金屬肽酶含血小板反應(yīng)蛋白(ADAMTs)-4、TAK1、TGF-β、IGF1、p-p65蛋白質(zhì)條帶灰度進(jìn)行相對定量分析。以目的蛋白條帶與 GADPH灰度比值表示蛋白相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，取平均值為最終結(jié)果。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0和GraphPda Prism5軟件進(jìn)行方差分析及SNK法。

2 結(jié) 果

2.1番紅染色結(jié)果觀察 Sham組大鼠軟骨基質(zhì)染色均勻，軟骨表層光滑無裂隙，細(xì)胞無簇集現(xiàn)象，無失染。潮線清晰完整；OA組軟骨基質(zhì)染色不均，表層細(xì)胞缺失，有的成簇狀，排列欠規(guī)則，染色稍淺淡，細(xì)胞排列不規(guī)則，層次交錯(cuò)、紊亂，潮線不完整，鈣化層增厚；GPS 50 mg/kg組細(xì)胞大小不等，成簇狀，排列不規(guī)則；GPS 100 mg/kg組中深層軟骨細(xì)胞增殖明顯，成簇狀分布，層次紊亂；GPS 200 mg/kg細(xì)胞大小不等，有的成簇狀，排列欠規(guī)則，層次稍紊亂但可辨認(rèn)。見圖1。

圖1 各組關(guān)節(jié)軟骨番紅染色結(jié)果觀察(×400)

2.2HE染色結(jié)果觀察 Sham組大鼠軟骨基質(zhì)染色均勻，無失染。潮線清晰完整；OA組軟骨基質(zhì)染色淺淡不均，血管自軟骨下骨長入軟骨鈣化層；GPS 50 mg/kg組染色淺淡不均，血管自軟骨下骨長入軟骨鈣化層，排列不規(guī)則，層次交錯(cuò)、紊亂；GPS 100 mg/kg組染色淺淡不均，組鈣化層增厚，鈣化層細(xì)胞較大，呈簇狀分布；GPS 200 mg/kg組染色稍淺淡。見圖2。

圖2 各組關(guān)節(jié)軟骨HE染色結(jié)果觀察(×400)

2.3各組MMP-13、cl-caspase-3、ADAMTs-4蛋白水平比較 與Sham組比較，OA組MMP-13和ADAMTs-4蛋白水平顯著升高，cl-caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與OA組比較，GPS組大鼠MMP-13和ADAMTs-4蛋白水平顯著下降，且GPS 200 mg/kg組顯著低于GPS 100、50 mg/kg組；cl-caspase-3水平顯著升高，且GPS 200、100 mg/kg組顯著高于GPS 50 mg/kg組(P<0.05)。見表1、圖3。

表1 各組MMP-13、cl-caspase-3、ADAMTs-4蛋白表達(dá)比較

1～5：Sham組、OA組、GPS 50、100、200 mg/kg組，下圖同圖3 MMP-13、cl-caspase-3、ADAMTs-4蛋白水平檢測

2.4各組IL-6、iNOS、TNF-α炎癥因子水平比較 與Sham組比較，OA組大鼠IL-6、iNOS、TNF-α炎癥因子水平顯著升高(P<0.05)；與OA組比較，GPS組大鼠IL-6、iNOS、TNF-α炎癥因子水平顯著降低，且GPS 200 mg/kg組顯著低于GPS 100、50 mg/kg組(P<0.05)。見表2。

2.5各組TAK1、TGF-β、IGF1、p-p65蛋白水平比較 與Sham組比較，OA組大鼠TAK1、TGF-β、p-p65蛋白水平顯著升高，IGF1蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與OA組比較，GPS組大鼠TAK1、TGF-β、p-p65蛋白水平顯著降低，且GPS 200 mg/kg組顯著低于GPS 100、50 mg/kg組，IGF1蛋白水平顯著升高，且GPS 200 mg/kg組顯著高于GPS 100、50 mg/kg組(P<0.05)。見表2、圖4。

表2 各組IL-6、iNOS、TNF-α炎癥因子及TAK1、TGF-β、IGF1、p-p65 蛋白水平水平比較

圖4 TAK1、TGF-β、IGF1、p-p65蛋白水平檢測

3 討 論

OA的發(fā)病過程中，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成與降解失衡中起決定性作用，其中MMP-13在骨關(guān)節(jié)炎的早期和后期均有高水平表達(dá)，MMP-13 也稱膠原酶3其降解Ⅱ型膠原纖維的能力是其他膠原酶的10～30倍，而且其他許多MMP亞型對Ⅱ型膠原的降解需要通過它們起作用〔11〕。cl-caspase-3是活化的caspase-3，這種有活性的caspase-3 可以通過剪切另外的caspase底物，達(dá)到引起級聯(lián)反應(yīng)的目的，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔12〕。ADAMTs-4又稱蛋白聚糖酶，是一種谷酰基內(nèi)切酶，可以裂解退行性關(guān)節(jié)疾病中關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的蛋白聚糖。陳志軍等〔13〕研究表明：膝OA患者關(guān)節(jié)液中ADAMTS-4表達(dá)水平均高于正常者。TAK1是MAPK和骨形態(tài)蛋白(BMP)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵信號調(diào)節(jié)分子并且在骨和關(guān)節(jié)發(fā)育中起著一定作用。本研究說明GPS可以促進(jìn)MMP對Ⅱ型膠原的降解，并且促進(jìn)損傷的細(xì)胞凋亡。劉煥等〔14〕研究得出；降低MMP-13水平可以降低OA的發(fā)生，與本研究相一致。孫志濤等〔15〕研究得出：使用ADAMTs-4抑制劑后，降低ADAMTs-4蛋白水平可以有效緩解膝OA患者的病情。血清中IL-6的水平與OA軟骨的破壞程度呈正相關(guān)，同時(shí)軟骨蛋白聚糖合成能力增高與滑液中IL-6的水平增高相關(guān)。血清中TNF-α、TGF-β的水平與OA的嚴(yán)重程度有關(guān)，同時(shí)也和滑膜的炎性變有關(guān)。本研究說明GPS可以有效降低大鼠體內(nèi)的炎癥因子的破壞作用，促進(jìn)TGF-β的修復(fù)，同時(shí)保護(hù)滑膜，達(dá)到緩解骨關(guān)節(jié)炎癥的效果。張艷霞等〔16〕研究得出，GPS可以通過降低炎癥緩解患者骨關(guān)節(jié)炎癥，與本研究相一致。

IGF-1是軟骨合成代謝的主要因子，不僅能夠保持軟骨細(xì)胞在正常軟骨中的代謝動態(tài)平衡而且可以在體內(nèi)改善軟骨的愈合。馬碧濤等〔17〕研究表明，膝OA患者關(guān)節(jié)液中IGF-1的含量較正常人顯著增高。核轉(zhuǎn)錄因子p65在OA大鼠脊髓內(nèi)表達(dá)量顯著增加。李云澤等〔18〕研究表明，抑制脊髓內(nèi)核因子(NF)-κB/p65的表達(dá)能明顯改善骨性關(guān)節(jié)炎大鼠的機(jī)械痛敏。本文結(jié)果說明GPS可以促進(jìn)軟骨合成代謝，并降低患者的疼痛，達(dá)到緩解OA的進(jìn)展。王華敏等〔19〕研究表明，升高IGF-1水平可以有效緩解OA的進(jìn)展，與本研究相一致。

綜上，GPS可以有效平衡ECM的合成與降解，達(dá)到保護(hù)骨關(guān)節(jié)組織的作用，其作用機(jī)制可能與降低體內(nèi)炎癥因子，促進(jìn)MMP對Ⅱ型膠原的降解相關(guān)。但影響OA與相關(guān)信號通路相關(guān)，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可以研究信號通路在保護(hù)大鼠OA大鼠軟骨組織損傷和軟骨細(xì)凋亡的作用機(jī)制。