腫瘤微血管密度、血管內皮生長因子與缺氧誘導因子-1α在腦膠質瘤中表達及其臨床意義

李航 于佳龍 羅勇 蔣其俊 楊開華

(遵義市第一人民醫院遵義醫科大學神經外科，貴州 遵義 563000)

腦膠質瘤是腦外科臨床中較為常見的腫瘤，依據WHO在2007年制定的分級標準，腦膠質瘤按照嚴重程度可分為Ⅰ～Ⅳ級，其中Ⅰ～Ⅱ級為低級別腦膠質瘤，Ⅲ～Ⅳ級為高級別腦膠質瘤〔1〕。腦膠質瘤在顱腦所有原發性腫瘤中，其發生率占比高達60%，以高發生率、高死亡率、高復發率及低治愈率為顯著特點，因此，對其發病機制及治療靶點的研究是臨床急需。腦膠質瘤的出現、浸潤和發展均和新生血管的出現及增長存在密不可分的關系。低級別腦膠質瘤患者的腫瘤血管并不豐富，新生血管的發育也較為成熟，因此其血容量和血流量的水平較低。而高級別腦膠質瘤患者的腫瘤血管十分豐富，血管的發育情況較差，具有較高的管壁通透性，因此其血容量和血流量的水平較高〔2〕。血管內皮生長因子(VEGF)和腫瘤微血管密度(MVD)是腫瘤新生血管增殖的兩個重要生化指標〔3〕。VEGF的表達受多種因素的影響，其中缺氧是迄今為止發現的最強的誘導VEGF表達因素〔4〕。缺氧誘導因子(HIF)-1α是受癢調節的特異性亞單位〔5〕。VEGF和HIF-1α在腫瘤的新生血管生長過程中發揮了重要作用。本文擬探討MVD、VEGF與HIF-1α在腦膠質瘤中的表達及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年1月至2019年1月遵義市第一人民醫院、遵義醫學院附屬醫院及貴州航天醫院的腦膠質瘤標本107例。依據神經系統腫瘤分類標準，包括WHOⅠ級膠質瘤6例，Ⅱ級膠質瘤43例，Ⅲ級膠質瘤37例，Ⅳ級21例。所有病例中男60例，女47例，平均年齡(60.5±4.2)歲。腫瘤類型包括：彌漫性星形細胞瘤25例、間變性星形細胞瘤9例、間變型星形細胞瘤22例、毛細胞星形細胞瘤6例、膠質母細胞瘤18例、少突膠質細胞瘤10例、室管膜瘤5例、髓母細胞瘤3例、間變性少突星形細胞瘤5例、少突星形細胞瘤3例、間變性室管膜瘤1例。取腦外科手術治療的正常腦組織標本20例為對照組。

1.2主要試劑 HIF-1α鼠抗人單克隆抗體由武漢博士德公司提供，VEGF兔抗人單克隆抗體由福州邁新公司提供。

1.3方法 (1)VEGF與HIF-1α檢測：標本經常規操作，10%甲醛固定、石蠟包埋、切片(厚度4 μm)、蘇木素-伊紅(HE)染色、免疫組化(SP)染色及光鏡觀察。根據SP試劑盒的操作步驟進行免疫組化，一抗濃度為1∶500，分別與陽性對照片比較。磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作陰性對照。閱片評分均由經驗豐富的病理醫師操作，分別用高倍鏡和低倍鏡觀察全片，如細胞膜或細胞質內出現棕黃色顆粒則VEGF及HIF-1α為陽性。每個切片隨機選擇5個高倍視野觀察，根據染色強度和陽性細胞數所占百分比計分。染色強度：無色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；陽性細胞數：<5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，>50%計3分。最后計算染色強度與陽性細胞數得分的乘積，0分為(-)，1-3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性()，5分以上為強陽性()。(2)MVD的檢測：提取出2張腫瘤病理組織切片，并予以石蠟包埋。其中取一張用于HE染色，對病理分級進行復核，剩下的一張進行CD34 SP染色。在檢測過程中嚴格遵循無菌流程及按照試劑盒說明書操作。若檢測結果為CD34呈陽性，則提示為微血管內皮細胞已經被染為棕色/棕黃色。依照血管計數法對MVD計數進行測定，首先在低倍鏡的直視下，擇取CD34陽性染色較多的熱點(5個)，其次再使用×200高倍鏡在各熱點范圍內進行數目計量。

1.4統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1腦膠質瘤與正常腦組織VEGF表達比較 高級別腦膠質瘤組VEGF表達水平明顯高于對照組和低級別腦膠質瘤(χ2=78.000、30.927，P<0.05)；低級別腦膠質瘤組中VEGF表達水平明顯高于對照組(χ2=19.223，P<0.05)，見表1。

2.2腦膠質瘤與正常腦組織HIF-1α表達比較 高級別腦膠質瘤組中HIF-1αF的表達水平高于對照組和低級別腦膠質瘤(χ2=60.517，36.162，P<0.05)；低級別腦膠質瘤組中HIF-1α表達水平高于對照組，差異有統計學意義(χ2=10.702，P<0.05)，見表1。

表1 腦膠質瘤與正常腦組織VEGF、HIF-1α表達比較(n)

2.3腦膠質瘤與正常腦組織微血管密度比較 高級別腦膠質瘤組中MVD計數〔(46.02±8.22)個〕明顯高于對照組和低級別腦膠質瘤〔(8.09±1.58)個、(24.01±8.11)個；t=20.422、13.884，P<0.05〕；低級別腦膠質瘤組中MVD計數明顯高于對照組(t=8.675，P<0.05)。

2.4VEGF、HIF-1α表達的相關性 VEGF與HIF-1α在腦膠質瘤中的表達呈正相關(r=0.315，P<0.05)。

3 討 論

異檸檬酸脫氫酶(IDH)突變與腦膠質瘤的發生發展關系密切〔6〕。IDH1基因突變后，其催化反應的產物轉變為2-羥基戊二酸(HG)，2-HG對膠質瘤干細胞分化具有抑制作用，2-HG還可上調VEGF的表達，加速腫瘤血管生成，促進腫瘤細胞增殖，并進一步促進HIF-1α的表達，使膠質瘤細胞的增殖侵襲能力進一步增強，推進腦膠質瘤的發生發展〔7〕。通過對腦膠質瘤分子病理機制的研究，找出與腦膠質瘤發生、發展、復發與轉移相關的關鍵調控因素具有十分重要的臨床意義。研究表明〔8〕，VEGF和HIF-1α是影響腫瘤細胞增殖功能和腫瘤細胞惡性侵襲的重要物質。VEGF是一種促血管生長因子，VEGF特異性表達于血管內皮細胞，功能強大，加速實體瘤周圍血管生成〔9〕。VEGF在腫瘤發展、浸潤和轉移進程中發揮關鍵作用〔10〕。另外，腫瘤瘋狂生長所造成的缺氧環境是實體瘤的一大病理特征。特別是HIF-1α高表達的腦膠質瘤壞死區域周邊的腫瘤細胞，由于持續的低氧環境刺激，往往表現明顯的遷移逃逸的趨勢，表明IDH1/2突變使腦膠質瘤細胞的侵襲性顯著增強〔11〕。因此，IDH1突變所致的VEGF與HIF-1α表達上調是腦膠質瘤發生發展的分子機制之一〔12〕。本研究說明VEGF、HIF-1α與腫瘤的進展過程關系密切，隨著惡性程度的增加呈上升趨勢，與上述研究相符。

作為缺氧應答調控因子，HIF-1α在多種惡性實體瘤中的表達升高，其可促進腫瘤新生血管的生成及產生增殖侵襲行為〔13〕。由于能量代謝必須要有氧的參與，而HIF-1α與氧的含量關系密切，因此，腫瘤細胞增殖侵襲的外在表現之一則為其對能量的追尋及不良環境的快速逃逸。文獻報道〔14〕，內皮細胞的增殖、分化、相關基因的表達受VEGF的調控，VEGF可誘導血管內皮細胞產生蛋白水解酶，對血管內皮細胞的生成、移動有促進作用。VEGF為HIF-1α所調控的信號通路上的下游因子。惡性實體瘤內的HIF-1α經過調控編碼VEGF基因，使VEGF mRNA表達增加而上調VEGF水平，VEGF的濃度及活性增加導致新生血管形成加快，顯著改變腫瘤微環境〔15〕。有報道顯示，HIF-1α和VEGF表達與腫瘤臨床病理密切相關，隨著病理分期越晚、細胞分化程度及浸潤程度越深、轉移，HIF-1α和VEGF的表達越高，提示兩者與腫瘤增殖侵襲關系密切，針對兩者的特異性治療也是臨床考慮的重要方向〔16〕。本研究表明，高級別腦膠質瘤HIF-1α和VEGF表達明顯高于低級別腦膠質瘤，其原因可能為高級別腦膠質瘤的生長過快，血管增生速度加快，同時相應的能量代謝也加快，導致腫瘤微環境缺氧，缺氧環境啟動腫瘤的自我保護機制，反饋性刺激HIF-1α的表達，進而導致VEGF的進一步升高。本文亦提示HIF-1α和VEGF可能對腫瘤的生長起協同作用。

另外，臨床對腫瘤新生血管數目進行檢測的常用指標為CD34標記的MVD計數，該指標敏感度高。有研究指出〔17〕，膠質瘤病理級別越高，則腫瘤細胞的生長與增殖速度就越快，對微循環的需求相應提高，導致局部供氧缺乏，上述病理改變進一步刺激新生血管的產生。本文提示MVD計數與腦膠質瘤病理分級密切相關，可為腦膠質瘤的病理分級提供數據參考。

綜上，HIF-1α和VEGF的表達上調預示腦膠質瘤病理級別越高，微血管密度計數可快速反映腦膠質瘤病理分級，三者可作為臨床判定腦膠質瘤惡性程度的生物標志物。